ES 2 344 691 T3
`
`Un “gcn“ es una rcgién definida quc csui ubicada denim de un gene-ma y quc, adernér. de la sccucncra dc érido
`nucleico codificanle mencionada antes, comprende olras secuenciaa de ficido nucleico, principalmente reguladoras,
`resfxnnsahleti Llel azunlrnl de la exprersiérr, es decir la I.ran:s‘C1‘ipr.:i(:n y la 1.1‘aduccii':n. de la pt:-re1'('1I1 unclificanle. Ur: gen
`también puede comprerrder otras secuencias 5‘ 5; 3‘ sin rraducir 3! secuerrcias de rerrninacién. (iltrns elernentos que
`pueclen estar presemes son, pot ejernplo, I05. inrtrorres.
`
`“Gen dc intel'é5" sc rcficre a cualquicr gen quc, cuandn cs l1'a.nsfcI'ido a una planla, le conficre a la plania una
`ca1'acler:‘5t:'::a cleseacla coma resistencia a los antihidlicos. resisiencia a log virus. resistencia a 105 insect-us. l'eSiSl¢nCia
`a la enfetrnedad 0 resis1.e11cia a uuas plagas. lnlerancia a lrerhicidas, mayor valor nulricicrnal, mayor rendimiento en un
`proccso industrial 0 capacidad rcproducliva allcrada. E1 “gen dc intcrés“ puede Lambién ser un gen quc m u'an5fiera a
`las plant-as para producir en la plantar cnzimas o metabolites cc-mcrcralrncntc valiosos.
`
`Una secueneia 111: acislu nucleicn “ire1e1'ci-Inga" es una secuencia de acidu nucleicu que nu-estai naLura1rnenLe asnciada
`a la célula huéspcd en la cual es introdueida, inclusive las multiples copies quc no son de c:-11'gcn na11u'aJ dc una
`secuencia de ficido nucleico que es de origen natural.
`
`Una scclrcncia dc acido nuelcico “horn-'31crga” es una secuelreia dc acrdo nucleico asocrada naturalrnelrte a la célula
`huésped en la usual :33 inlroducida.
`
`::
`
`In
`
`I5
`
`2n
`
`"Reco1nbina-:iu:S11 11cn1nc’nloga“ es el i111e:'cam|::-ic: recfproco de fragrnentos de zicido nucleico enire me-léculas de écido
`nucleico holnélogas.
`
`25
`
`“Tu-xina hibL'ida" comm 5e usa en esle doc urnento es una lclxina ilrseclicida elaburada per el hombre que curnprende
`rcgiorlcs dc aminoricidos 0 fragment-:-5 dc una toxina unrclas con rcgiones dc arrunoaicidos 0 fragmeutos. dc otra toxina
`diferenle. For ejenlplo, pero no exelusivamelrte. unir la regién C.-terminal de Vip3C. desde los amrnoacidos 661 a T88
`dc SEC. ID. N": 2, con la regién N—le:'mina] de Vip3A, desde los aminnacidos 1 a 660 do SEC. 11). N": 5, crea una
`toxina hfbrida con una secumrcia de arninoficidos que se expone en SFC. 11'). N“:
`I 1.
`
`3:)
`
`103.
`
`“Inseu:tiu:iI:la" se define DOI‘J1(l una actividad hiolégiea rdxica capaz cle L‘OIl|'.l'0lfl1' insectucns, pret'erenIen1ent-: nrai.=indo—
`
`35
`
`40
`
`45
`
`50
`
`55
`
`6(:
`
`Una secuencia de auidn nuclelco es “is.nc0dil"rL‘anIe con" una secuencia de acids nucleicn de referencia cuandu la
`sccucncia dc acids nucleico codifica un poiipéptido que Eicnc la mrsrna sccucncia dc amrnoricidos quc cl polipépudo
`codjficado por la secuencia de acido nucleico de referencia.
`
`Una molécula dc aicido nuclcico “aislada“ 0 una protefna o toxjna aislada es una rnolécula dc acido nuclei-:0 0
`pmleina 0 toxina quc, por la aceién dc] lmmbrc, -'.-xistc aparle dc su u.:utor11o natural y por lo tame no es u11 product-.1
`de la naturaleza. Una molécula de ficido nucteico 0 prolefna 0 mxirra aislada puede existir en forrna punfieada 0 puede
`exjslir en un enlurno no natural culno, p01‘ ejemplu, una célula huésped recnnrb-inanle 0 una planla uansgenica.
`
`Native: se refiere a un gen que eslzi presente en el genoma de una célula sin 11~a.nst'nrmaI.
`
`Dc origeu natural: la cxprcsicilr "dc origcn natural" so 1135. para c1cs:c1'ibi.r un objcto quc so pucdc cncontrar en la
`nalu1'alez.a en vez the set producido anificialrnerlle por el hombre. For ejenlplo. una protefna 0 sec uencia de nucleétidos
`presenle en un organismo (inclusive un vim 5), que se puede aislar de una fueme de la naluraleza y que no ha sido
`iIru:m.:iurraJtna.-nLa.: rnndifiuada per cl lrurnhru an e] labor‘-aLuriu-, as de m“lg::I‘1 natural.
`
`Una "rrlolecula de aicido nucleicc-" 0 “5e::uencia de aicido nucleico" es un segmenlo lineal de ADN 0 ARN n1ono~
`catenario 0 bicatenario que se puede aislar de cualquier fuenle.
`l'-Ln el er-ntexto the la present-I-3 ilwencién, la molécula
`de écido nuc]e1'co es prefererrtemente un segment-:3 de ADN.
`
`Una * planta“ es cualquier planta en cualquier etapa del desarrollo, particularmente una planta dc semilla.
`
`Una “célula vegetal" es una unidad e5l:11etL1ra1 3' fisjnlégica de una plauta. que eomprencle uI1 protuplastn y una
`pared celular. La celula vegelal puede eslar en lhflflfl de una unica celula aislada 0 de una célula <:u]li\'ada, 0 CUITIO
`partc dc una unidad 0-rgarrizada mayor Como. pm‘ cjcrnplo. cl tejido dc una planta, cl drgalm dc una planta c- una planta
`enlera.
`
`“(Ttlltivo cclular vcgctal" sigrufica ctrllivor. dc uniciadcs vcgclalcs. por cjcmplo, protoplastos, céhllas dc cultivo cc-
`lular, células de tejidu-s de plantas, polen, tubes de polen. évulos, saws embrionarios, cigotos 3' embriones en diversas
`elapas del clesarrnll-n.
`
`“Mar-aria] vegetal" SE! refiere a hojas, Lallos, raises, fiorcs 0 parles dc flares. frulas, polen, eélulas huevo, cigotos,
`semillas, gajos, cultivos celulares 0 tisulares, 0 cualquier otra parle 0 pmduclo de una planla.
`
`Un “érgano de una planta" es una pane defiruda 3' visiblernente estructurada 3' diferenciada de una planta COITIO
`una rail, un tallo, una hoja, un bolén de una flor 0 u11 embrién.
`
`8
`000301
`
`BEDGEAR 100? (part 4)
`IPR of U8. Pat. No. 8,402,580
`
`

`
`ES 2 344 691 T3
`
`“Tojide vcgctal” come so usa en cstc decurncnto significa uu grupe dc células vcgctalcs ergauizado on una uuidad
`estructural y iuncional. Se incluye cualquier tejide vegetal en una planta e en cultive. l:;ste términe incluye, pere
`no exclusivamente, l.'-1 planla enters. his (irgaues de la plarlla, las semillas de la plzinla. el cultive lisular y tedes Ins
`grupes de células vege-tales ergauizadas en unidades estructurales 3-‘ funcionales. El use de este [ermine junte com,
`o en ausencia de, cualquier tipe especifico de tejiclo vegetal come los inclicados antes o que de otra rnanera este
`cernprendide per esta delinicien, no prelende ser exclusive dc rlinglin elre lipe de tejide vegelal.
`
`Ln “promoter” es una secuencia ADN sin traducir secuencia arriba de la region codificante que corniene el sitie
`de unien para la ARN pelimerasa ll }' qua: inicia la lmtiscripcien del ADN. La region del prerneter larnbién puede
`iueluir elres elcmerttes quc actuan ceme reguladeres dc la expresién do les genes.
`
`Lu “p1'ele-pla.sI.e” es Una célula vegelal aislada sin pared I.:elula.1'u so-le cell panes de la pared celular.
`
`“lllcrncrttes rcgulaclercs" sc rcficrc a las sccu en ci as quc parlioipan cu cl ceutrel dc la cxptesien do una sccuoncia do
`nucleotides. Les elementos reguladeres oemprenclen un promoter unide eperativamente a la secuencia the nucleotides
`de in erés y a las sefiales tie lerirlinacifm. También cemprendert lip-ica merlle las secuencias requeridas para la [red uccien
`adccllada dc la seouclioia dc rnlclcétides.
`
`Sustancialmeiile idénlicasz la Fluse “suslulicialmenle idénliuas”, en el centexln (in: des secuencias de :1-side 11LIr.:Ieiee
`e prete1'uas, se refiere a des e mas secuertcias e subsecueucias que tieneu :11 metres 60%, prefereittemeiite 80%, mas
`prcfcrcntomentc 90%. a1.'u1 mas prcfcrcntcmcntc 95%, y muy prcfcrcmcrncttte al rncnes 9'9‘/o dc identiclacl en [es rc-
`sidues tle nucleotides o arnilteacides. cuando se les compare 3* ahnea para mzixima eerrespentleneia, segtin se mide
`usartde uno de lus algerilrnes de t:empa1'aci611 de secuertcias siguientes e rnevdianle inspec-Lien visual, Prel'e1'eulemerl—
`to, la idcntidad sustanoial cxistc en una region do las secuoncias quc cs dc al recites aprexirriadamcnle 50 residues
`dc lengitud, més preferentemente en una iegien de al menes aprexirnadarnente 100 residues, 3' muy preferentemente
`las secuencias sou sustancialmente idénticas en al menes apreximadamente 150 residues. En una realizacien especial-
`mente preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas en teda la lengitud de las regienes codificantes. Ademfis,
`1215 secuencias de zicicle nucleice e pretefuas sustancialmente iclénticas realizaut préctioamente la. misma. funci-en.
`
`Para ls cemparacién dc secuciicias, habirualmcntc una socuoncla scttis come secucncia dc rcfcrcncia rcspocte
`a la cual se cemparan las secuencias cle prueba. Cuando se usa un algeiitmo de cemparacien de secuencias,
`las
`seeueneias de prueba 3; de referettcia se ingresan en uua eemputadera, se designan tseerdenatlas de subsecuencias
`si cs no-zcsarie, 3: so dcsignen I-es parémctres dc] programs do algeritmo do sccuoncias. Dcspués cl algeritmo do
`cemparacien de secuencias calcula el percentaje de identidad de las secuencias para las seouencias tie prueba eon
`resp-ecle a la secuericia de referencia. basaindese en les panimelres designades del programs
`
`El alineamiciite eptime dc las sccucncias para cemparacieii SC pucde rcalizar, per cjcinplo. mediamc cl algeriune
`de hemelegfa local tle Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritme de alineamiente de
`ht:-rrielegia tie Needlerrlan (E: Wutisch, J. Mel. Biol. 48: 443 (1970), rnediarlte la hflsqueda de similitud por el métede
`dc Poarseti 3.: Lipman. Prec. Nat’l. Acad Sci. EE.UU 85: 2444 [1988]-. modiantc irnplcmcntaciencs cemputarizadas do
`eses algeritmes (GAP. B]:LS'l‘l~‘l'l‘. FAS'l'A 3-‘ 'l‘FAS'l‘A en el paquete de pregramas inferméiticos the Wisconsin Genetics.
`Genetics Cni11pI1Ie1'("1rnII]1, 575 Science T)r_, M:|(|isr1n,Wl),:i rnedianle inspecciciii visllsil (t:f'J]‘J.~11]llIi en general, Ausuhel
`er! at. mzis adclatitc).
`
`Un ejernple de un algeritme que es adecuade para determiuar el percentaje de idemidad de secuencia y sirni]i—
`[Lid dc .‘~iI.:L2LIL;I'|Lti:1 cs cl algeritme BLAST, quc st: describe an Allschul 2: at, .T. Mel. Biol. 215: 403-410 (1990). E]
`programa infermatice para realizar anélisis BLAST estzi dispenible para el ptiblice a través del National Center for
`Biotechnology lnlermalien (hllp:2‘l'www.ncbi.nJm.11ih.gew'). Liste algerilrne implica plimere identilicar pares de se-
`cuencias con puntajes altos [HSP, per sus siglas en inglés] rnediame la identificacien de palahras certas de lengitud W
`en la secuencia de interregacic‘-n. con un puiitaje umbra] T de correspond-encia exacta o alge positive cuande se alinean
`con una palabra de la lTll.Sl1'J.a lengitud de una seeuelicia de una base de dates. T es el puntaje umbral de las palabras
`del vecindarie (Altschul at m'., 1990}. Estes secuencias similaies (hits) injciales del veciudarie acnian come semillas
`para iniciar btisqucdas para cnoentrar pares -do scgrncntes dc alto puntajc {HEP} mas larges quc las centcngan. Las
`secueueias similares (hits) de palabras se extienden después en ambas direecieues a. le large de eada secuencia Ian
`lejes come se pueda ineremeiitar el punlaje de alineamienle acumulado. Les purltajes aculnulades se ealculan usarlde.
`para las SCI21lC]1CiaS dc nucleotides, les paramctres M (pl.]l1La_]C dc rccempcnsa para un par do residues qut: so aparean;
`siempre> O] y N (pulitaje de penalizacien para residues que no se aparean; siempre -c D). Para las secueneias de ami-
`ueaicides se use um: matriz de punluscién para calcular el puntaje acumulade, La exlensié-u de les hits de palabms en
`cada Izlirccoien SE‘. deticnc cuande cl ptmtaic dc alincacirin attumulade oat: fuera en la cantidad X dc su maxime valor
`alcanzade, el puntaje acumulade tiende a were 0 per debaje debide a la acumulaeion de Luna 0 mas alineacienes de
`residues con pultluucien negative, 0 cuande se alcanzu el extreme de ulguna de Ins secueucias. Les parsintelres W, T
`3' X del algeritme BLAST determinan la sens-ibiliclacl 3' la velecidad de la alineacien. El pregrama BLASTN (para
`secuenoias dc nucleetides) usa per defcote uua lertgltud dc palabra (W) do 1 l, una cxpeotativa (E) do 10, un oerte do
`100, M = 5, N = -4 y una cempa1'a::ie11 de ambas hebras. Para la secuencia de amineaeides, el programs Bl_.AS'l'P
`usa per clefecte una le-ngitud de palahra (W) de 3, mm expectativa (H) de I0 y la matrix the puntuacien HI ,0-SlJM6’3
`(consulte Henikeff & Henikeff, Prec. Natl. Acad Sci. EE.UU. 89: 10915 (1939)).
`
`I0
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`I5
`
`25
`
`3!)
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`:10
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`-45
`
`60
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`'9
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`000302
`
`

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`ES 2 344 691 T3
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`I0
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`15
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`25
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`30
`
`Adcrnzis dc calcular cl porccntajc dc idemidad dc sccucncia, cl algoritmo BLAST también rcaliza 1111 analisis
`estadfsti-:0 de la similitud entre dos secue111:ias (ceneulte, por ej .._ Karlin 8: Altschu], Proc. Nat'l. Acad. Sci. l:'.l:l.U U. ‘)0:
`5873-5787 (1993)). Una rnedida de la siinililud pmvisla p(1r el alg111'ilm(1 BLAST es la menm SU1'l'lii de ]'J]'()1‘.01':1lTl11lJi:ldB.‘i
`(P(N)‘1, que proporciona una indieacien de la prehahilidad per la cual o1:u11'ir1‘a un aparearnienm entre dos secuencias
`de nucleétidos 0 aminoacidos al azar. P01 ejernplo, una secuencia cle zicido 11uc]e1'co de prueba se considera similar a
`una secuencia de releiencia si la menor 5u111a de pmbabilidades en una compa1'aci-511 de la secuencia 111: {wide rlucleico
`dc prucba con la sccucncia dc acido nucleico dc rcfcrcncia cs melior dc apmximadamcnte 0.1, mas pinfcrcntcmclitc
`menor de aproximadamente 0.01 5* muy prefe1‘enler11enIe r11e11or cle aproximaclamenle 0.001.
`
`Otra indicacié-11 dc quc dos sccucncias dc acido nuclcico ac-n sustancialmcnlc idénticas cs quc las dos molecules so
`hibridcn cntrc 3.1 cu coiidicioncs 1‘c5.Lrictivas. La frase “$1: hib1‘idacspccifica111cntc con“ 31': r1:f11:11c :1 la 1.1r1ic'1r1, duplieacién
`£1 11it11'i-L1aci1311 de una Inulécula. 513111 con una. secueiluia. de liucleiilidos parliL‘ula.1: en L1Jl1L11C1lJlll:5 It3Sll'lCl1\«"c1.5. cuaiido
`esa secuencia eslzi presenle en una mezcla cempleja (p. ej., celular 1111111) de ADN 1.1 ARN "Se u11e su5lancial111e11le"
`se rcficrc a la hibridacién complcmcnlaria cntre un aciclo l'll1ClC1CO some 3' u11 aside nuclcico blanco 3' abarca los
`apareamienl-05 err(>11e-as menores que se pueden acemodar reduciendo la restriccimi del media cle hibridaciéli para
`lugrar la deleecién deseada de la seeueneia de aicide nucleicu bla11<:1.1.
`
`Las “1.‘ondiciones cle hibridaeiéii 1'esLrirctiva5" 3' “condicioiies de lavado de hibridacién restrictivas" en el context-3
`de 111:; expe1'ime11l:15 de l1ihrid111:i(’1n de eicidu 11ue1eic(1 cnrnn 1115 hib1'idaLci011e.~a Sc11Jl.l1err1 y Northern 5011 dependienlea
`de la secuencia 3' son difenenles bait: paréiiietres ambiemales difereiiles. Las se-:ue11-zias rneis largas se hibridan espe-
`cificamcnlc a mayorcs tcmpcraturas. Una gufa cxtcnsa para la h1'b1‘idaci6n dc acido nuclcice sc ciicucntra cu Tijsscn
`([9931 Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bi0legy—Hybr1dizati:1n with Nucleic Acid Probes parte
`I, capilulo 2 “Overview of pri11:.'iple5 of l1}'b1idizalio11 and the strategy of nucleic acid pmbe aways” Elsevier, N ueva
`Yc-rk. G-;:11cral11:1cntc. sc sclcccionan las condiciomrs dc h1'b1‘idaci6n 3* dc lavado muy rcslrictivas para quc scan apro-
`ximadamelite 5°C per clcbajo del punlo de fusién lémiice (T...) para la secuencia especifica a u11a fuerza i1511i1:a 3' p11
`delinides. 'l'1'picame11te, una soncla "en coiicliciolies rest1'iclivas" se hibridara con S1] subsecuencia b-lance. pero no can
`otrzu; secuencias.
`
`La '1',“ es 1aIe111pe1'atura (e11 [115 co11c1ieie11e5 de tiierza ir'J11i1:a 5? pH defiiiidas) a la usual 50% de la s.e1:ue11cla blaiico se
`hihrida con una sonda quc corrcspoiiclc pc1'fc1::‘1amc11lc. Las condicioncs muy l'CSI1"iCliVa5 so selcccionan para quc scan
`igual a la 'l‘.., para una sonda e11 particular. U11 ejemplo de condicienes de hibridacién res trictivas para la hibrida.ci1:i11 en
`un I'1lLr0 de iicidos nucleicos 1:0r11ple111e11la1i0s que lengan 11111:‘. de 100 residues colnplemenlaiies, e11 una l1'ansl'ere11cia
`Soulhcrli 0 Ne1'thc1'11, cs. 50% do formainida con 1 mg dc hcparina a 42°C, dondc la hibridacicili ac Ilcva a cabo cluralilc
`la noche. Un ejemplo de condicienes de lavado rnuy 1‘esLrictivas es NaC‘.l 0.15 M a 73°C durante aproxirnadamente
`15 minutes. U11 ejemplo de c011dici1111es de lavadu resirictivas es u11 lavad-0 can 0.3 11 SSC a 65°C duranle l5 minul-Us
`(consult-2, Sambrook, mas adclantc, pot una dcs«c1'ip1:ic'>11 dcl ‘1an1pc’1r1 SSC). A mcliudo, un lavado mu)! 1'cst1'icti\=o cs
`prcccdido P01‘ un lavado dc baja 1'1.>st1'iccic'1n para cli1111'11a1' la scfial dc fcuido dc la sonda. U11 cj1:1'.r1plo dc lavado c011
`restriccifin media para un duplex de. per ej.. mas de 100 nuclemidos, es 1 x SSC 21 45“C durante 15 mi11u11:1s. U11
`ejemplo de lavado con baja resl1'11:cir.'111 para mi diiplex Lie, poi‘ e_i., mas de 100 iiucleélidos, es 4 a 6 x SSC‘.
`11 40°C
`durantc 15 minutes. Para sondas 1:o11a.s v[p. cj, dc ap1‘eximada.111c11tc 10 a 50 nuclec’>lid-1:15], las condicioncs 1'csLri1::tiva3
`implicali COllCeI1I1‘3.Ci0[1E5 de sal menores de aproximaclamenle 1.0 M de id-n Na.l1'picamente una concentraciéli entre
`11p1'-m1in'1111l11rner1Ie 0.01 3.1 1.0 M de itin N11(I111Ir:15 .~1111e.~:] 11 pH enlre 7.0 3' 8.3, y la Iemperatilra es; Ifpieamenle :1l111enns1'.
`aproximaclamcnlc 30°C. Tambiéii sc pucdcn lograr las conclicioiics rcstrictivas agrcgando agcntcs dcscstabilizantcs
`cemo formamida. En genera]. una relacién sefial ruide de 2 x Q1:: superior) a la observada para una sonda no relacionada
`con el ensaye de hibridacién particular, indica deteccidri de una hibridaeién especflica. L103 acidos nucleicos que 110
`111; hibridmi 131111:
`111' 1:11 1:0n11i1.-ic1r11:>1 remiclivas 111111 111111 .~1u.~;la111:1'alrn1.-nle 1'1.11E11Lieus si 111:; pr«.1Lefr1-as quc 1:01.11‘ I11;-.111 111111
`susta11c1'a1me11Ie idénticas. Esta 1:1cu11'e. por ej., cuando una 1:-apia de 1111 acid-11 nucleico se crea. usandn la 1113.1-Lima
`degeneracién de codéli perrnilida por el cédigo genetics.
`
`55
`
`Lo-s siguientes s-011 ejemplos de co-11_iu11tos de condiciolies de hibiidaciénfllavado que se pueden usar para clonar
`secuencias. de l1LlC1E:5llC1OS homélogas que son sustancialmeiite idénticas. a las secuencias cle nucleétidos cle referelicia
`de la presente invencic'1n: una seucuencia de nucleé-tidos de 1'efe1'encia se hibrida preferentemente con la secuehcia de
`nuclcétidos dc rcfcrcncia cn s-:1-lucien dc dodccilsulfato dc sodio (SDS) a1 '1"}’.r1, NaP-O4 0.5 M. EDTA 1 111M a 50°C con
`lavado en 3 X SSC. SDS a1 0.1% a 50°C, 111215 deseablemelite en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, Na.PO.1 0,5 M,
`l:lD'l‘A 1 mM :1 50“'C 1:011 lavado en l X SSC, SDS :11 0.1% a 50°C, min mas deseablemenle e11 dodecilsullalo de 501110
`(51.15) a] 7%. NaP('J4 0.5 M. EDTA 1 111M a 50“C.' con lavado on 0.5 X SS-C, STJIS al 0.1% a 50°C, pi'cfc1'c11tcmcnlc 1:11
`dodecilsulfato de sodio (SDS) a] 7%, NaPO.. 0.5 M. EDTA 1 111M a 50°C con lavado en Ill X SSC. SDS a1 0.1% a
`50°C, mas preferenlemeiile en dodecilsulfato de sodie (SDS) al 7%. NaPO4 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C‘. con lavado en
`0.1 X SSC, SDS a1 0.1% a 65°C..
`
`Otru indicaci-1511 de que dos secuencias de zicido nuclei 1:0 0 pmteinas son 5usuu1ci11|rr1enI.e idélilieas es que la pru-1.ei1111
`codificada por el piiiner acid-1:1 nucleico lenga reactividad iiimunolégica cmzada con, 1:1 5:: mm especificamente a, la
`prolcfna codifi-Jada 1301‘ cl Segundo acids liucleicc-. For 10 tame. una proteina cs lipicamclilc sustancialmcnlc idéntica
`a una seguncla pm‘1e1’11a, poi‘ ejernplo, cuando las dos preieinas difieren S-010 en suslituciones co11sen"alivas.
`
`“Si11tética” se refiere a una secuencia de 11111:1e<SIid1:1s que comprende caracteres esmuctuiales que no estan presemes
`e11 la 51ECUEl‘lC1a 11atu1‘a.1. Per ejemplo, una secuencia artificial que se asemeja lo mas posible al coiitenide de G+C y a
`la distribucién normal de codones de 105 genes de dicotiledéneas yfo r111:1nocoti1edc'111eas se dice que es sintética.
`10
`
`000303
`
`

`
`ES 2 344 691 T3
`
`“Transforrnaci6n" -25 ml proccso para introducir écido nuclei-:0 hctcréologo en una célula 11 organismo huéspcd. En
`particular, “transform:1cién" significa la i11tegraci6n estable de una molécula de ADN en el genoma de un organisInc-
`dc inlerés.
`
`"Tra.nsfonnaclofLransgéni¢o!recom|:ainante" se refiere a1 L:-rganismo huéspecl como una bacteria 0 una planta en la
`cual 5:: ha inlroducido 1111:-:1 molécula dc aicido 11u:.']e1':.'0 helerélogo. La muléc ula dc ziuido nuclcico pu L-:11: eslarinlcgrada
`cstablcmcntc (:11 Cl gcnoma do 1111 huéspcd 0 la molécula dc :icido uuclcico Iambién pucdc cstar prc5cI1tc como una
`molécula extracromosomica. Dicha molécula extrawomosémica puede ser autorreplicativa, Se comprende que las
`células. 105 Lejidos 0 las plaulas transfolmados abarcan no 5610 el producm final dc un prc:-ceso dc Lransfonnacid-n, sino
`Iambién su progcnic t1'ausgé11ica. U11 huéspad “no transformadcf‘, “no l1'ar1sgc'nico“ 0 "110 rccombinanlc“ sc rcficrc a
`un organisrno silvcstrc, p. cj., una bacteria 0 planta, quc no conticnc la molécula dc ficido nuclcico hctcrélogo.
`
`La “class: dc pru1c1'11as Vip3" cumplende V‘ip3A{a), Vip3A(bJ-, Vip3A(c), V'ip3B, Vip3C(a), Vip3('.(b), V'ip3Z 3'
`sus homdlogos. “llomdlogo” SC usa en todas partcs con cl significado dc quc la prolciua 0 polipépliclo iuclicaclc-
`tiene una relacién definida con 0-tms miembros cle la clase de pro-teinas Vip3. Esta relacién definida incluye. pero-
`110 exclusivamenlzt, 1) pruteinas que sun al menos 70%. mils prcferememenle al menos 80% y muy prel'e1'enle1m:nL&:
`al mcnos 90% idénticas a nivcl dc la sccllcncia cc‘-11 otros illtcgrantcs dc la clasc dc prolcinas Vjp3 mantcnicudo
`simulténeamente la actividad plaguicida, 2) protefnas que tienen reactividad cruzada con anticuerpos que reconocen
`1n1nun(:|(')gicamen1e mm integmnle de la class the prulefnus; Vip3, 3) pI'()[Ei11iJ5 qua: lienen reuclividad urumda coll un
`receptor para out: imegrante de la clasc dc prolcinas Vipfi }-' que retienen la capacidad para inducir la muarle celular
`programada, y 4) protcfnas quc 5.011 a] mcnos ?0"?’u, mzis prcfcrcutcmcnlc al mcnos 80% )' muy prcfcrclllcmcntc 3.1
`menus 90% idénlicas. :1 nivel de la secuellcia. con la regién central tfixica de otro integrante de la clase de pmteinas
`Vip3 munlelficndu simulltincurnculc la a::l1'\=idud plaguicidu. Olros humé-lugus V1'p3 Si: divulgaron en WO 98518932,
`WO 98133991, W0 98J00546 3' W0 9935’.-‘E83.
`
`Les nucleétidos se indican pm" 3115 bases mediame las abrevialuras esIe'u1da1' siguientes: aclenina (A), citosina (C).
`tirnina (T) 3' guanina (G). De igual manera 105 aminozicidos: se indican mediante las abreviaturas esuindar siguie1nes:
`alaniua (Ala; A}. arginina. (Arg; R), a.spa1'ra.gina (Asn; N), zicido aspéxtico (Asp; D), cistefna (Cys; C), glutamina (G111;
`Q), ticido g|ut':iJ11icc: ((3111; 1:1), glicina ((31);; G), llistidina (His; H), isoleuclua (116; 1), leucina (Lou; L), lisina (Lys;
`K), mclionina (Met; M}, fcnilalanina (Phc; F), prolina (Pro; P], scriua (Sc:r', S), lrcouiua (Thr; T), Iriplofano (Trp; W),
`tirosina ('15::-. Y) y -.ralina(\"a1: V).
`
`Des-cripcién detallada de la invencidn
`
`Esta invenci611 st: refiert: a secuencias Lle écid-0 nu::1eicu cuya cxpresidn produce nuevas loxinas. y a la prepa.raci(t+n
`3' use dc las loxinas para contmlar plagas dc inscctos. L215 sccucncias dc aicido nuclcico dcrivan dcl Bac'éNus. un
`1ni-::roo1'ga111smo gralnpositivo founador dc csporas. Eu particular. sc p1'opo1'ci-3113.11 uucvas protcmas V’1'p3, Ijtilcs CCI-I':1O
`plaguicidas.
`
`A 105 fincs dc la prcscntc i|1vc11cic’>n. Jas plagas dc iuscclos irlcluycn inscctos sclcccionaclos dc, per qicmplo. los
`érdenes Coleoplera. Diptera. Hymenoptera. Lepidoptera. Mallophaga. 1-lomnptera. Hemiptera. (Jrthroptera. 'l‘hysa—
`nnplem, Derrnaplcra, Isrnlmlem, A]'I()]'3]I1I'd, Siphnnaplers y Tri::l1n]1Ie1'sa, psarliclllarmenlt: '[.::p1'dc3pI-em.
`
`L35 tablas L a T pro-porcionajl una lista de plagas asociadas con las planms de cultivo principales. Dichas plagas.
`cstén incluidas en el campo dc acciéll de la invencién.
`
`(Tabla pasa a pfigina siguieme)
`
`I0
`
`I5
`
`25
`
`30
`
`:10
`
`-45
`
`60
`
`1|
`
`000304
`
`

`
`ES 2 344 691 T3
`
`TABLAI
`
`%Lepidoptera
`
`S
`
`gusanoi
`exigua,
`nubilalis,-Spodoptera
`§Ostrinia
`'
`!
`gbarrenador del maiz europeo
`isoldado de la remolacha
`
`10
`
`gagrotis
`ipsilon,
`icortador grasiento
`
`gusano:PectinQphora
`llagarta rosada
`
`gossypiella,§
`
`gflelicoverpa
`ielotero
`
`zea,
`
`gusanoiscirpophaga
`ibarrenador
`
`innotata,§
`blanco
`deli
`
`étallo del arroz
`
`Efipodoptera frugiperda, gusan0:Cnaphalocrocis medinalis,§
`Ecogollero
`zenrollador
`de
`las
`hojasg
`fdel arroz
`
`:Diatraea
`
`3!)
`
`ébarrenador
`
`del
`
`Esudoeste
`
`plejadellus,§
`grandiosella,:Chilo
`del barrenador del
`tallo dela
`'arroz
`
`maiz
`
`dapunctalis,
`lignosellus,'Nymphula
`§Elasmopalpus
`taladrador menor del tallo de qusano envainado
`
`maiz y arroz
`
`;Diatraea
`ibarrenador
`
`de
`
`litura,
`saccharalis,:3podQptera
`la
`cafia
`de gris del
`tabaco
`
`gusanoi
`
`Eazficar
`
`mauritia,§
`Efleliohtis Virescens, oruga de Spodqptera
`Ela cépsula del algodén
`-gusano soldado del arroz
`
`incertuias,
`§5ci:pophaga
`ftaladrador del arroz amarillo'
`
`§Chilo polychrysa, chilo
`
`-45
`
`50
`
`55
`
`12
`
`000305
`
`

`
`ES 2 344 691 T3
`
`§Lepidoptera
`
`polillai
`hospes,
`§Mythimna separate, cuncunilla Cochylis
`Ede las chacras
`de bandas del girasol
`
`%Chilo partellus,
`
`barrenador Pseudaietia
`
`unipunctata,%
`
`gmanchado del tallo del sorgo 'gusano soldado
`
`}FEJtia
`
`subterranea,
`
`cortador'Agrotis orthogonia, gusanog
`icortador del oeste
`f
`
`.0
`§HCmeos0ma electellum, p0lilla§Pseudoplusia
`Edel girasol
`
`gusano de la soja
`
`incIudens,E
`
`Anticarsia
`
`gemmatalis,;
`
`orugd dzul del frijol
`
`Plathypena
`
`scabra,
`'verde del trébol
`
`gusanoi
`5
`
`TABLA2
`
`écoleoptera
`
`gfiiabrotica Virgifera, gusano Phyilophaga crinita, gusano
`ioccidental
`de
`la raiz del blanco
`imaiz
`'
`
`ifliabrotica
`longicornis, Mélanotus
`!
`Egusano nortefio do
`la
`raiz Conoderus,
`
`39?-:
`
`Eleodes,
`
`y Aeolus 3pp.,
`
`gusanos de alambre
`
`ifliabrotica
`
`undecimpunctata,§Ouelma
`
`melanopus,
`
`Egusano surefio de la raiz del escarabajo del cereal
`amaiz
`
`borea1is,;Cnaetocnema
`
`pulicaria,
`
`Ecyciocephala
`iescarabajo
`enmascaradojescarabajo negro del maiz
`Enortefio (white grub}
`gcyclosephala
`borealis, Dulema
`Eescarabajo
`enmascarado escarabajo del cereal
`isurefio (white grub}
`
`melanqpus,
`
`1'3
`000306
`
`IE)
`
`IS
`
`3!)
`
`:10
`
`-45
`
`50
`
`6U
`
`65
`
`

`
`ll)
`
`3!)
`
`-45
`
`50
`
`55
`
`ES 2 344 691 T3
`
`Ecoleoptera
`
`§Popillia
`Eescarabajo japonés
`
`japonica,§Hypera _punCtata, picudo deg
`51a hoja del trébol
`
`Echaetocnema
`
`pulicaria,iAnthonomus grandis, grilloé
`Ede
`la
`Eescarabajo negro del maiz
`Eaigodonero
`
`cépsula
`
`del;
`
`Ssphenophorus maidis, gorgojo Colaspis brunnea, gusano de%
`cuerno de la vid
`gdel maiz
`
`Lissorhoptrus
`
`oryzophilus,§
`
`gorgojo acuético del arroz
`
`5
`
`'Sitqphilus Uryzae,
`del arroz
`
`gorgojoé
`
`Epilachna
`escarabajo
`frijol
`
`variVestis,§
`mexicato
`deli
`=
`
`TABLA3
`
`§Homoptera
`
`;Rhopa1osiphum
`Epulqén del maiz
`
`maidis,
`
`.P5eudat0mosCelis
`
`seriatus,?
`
`ipulga saltona
`
`Eflnuraphis
`
`maidiradicis,
`
`*Trialeurodes
`
`abutilonea.
`
`Epulgén radicular del maiz
`
`Emosca blanca bandeada
`
`gsipha
`
`flava,
`
`pu1gén'Naphotettix
`
`nigrqpictua,
`
`iamarillo de la cafia
`éschizaphis graminum, pulgén‘Myzus persicae, pulgén Verde?
`del melocotonero
`Everde de los cereales
`
`-saltador de hojas del arroz E
`
`§Macrosiphum avenae,
`Ede la espiga
`
`pulgon=Empoasca fabae, chicharrita
`
`éflphfs gossypii, pulgén del
`éalgodén
`
`14
`
`000307
`
`

`
`ES 2 344 691 T3
`
`TABLA4
`
`§Hemip:era
`
`leucqpterus Acrosternum hiiare,
`iBlissus
`éleucopterus, Chinche
`"Verde hedionda
`
`chinchei
`
`lineolaris,
`§Lygus
`Eligus deslustrada
`
`servus,
`chinche'Euschistus
`-parda hedionda
`
`chincheé
`i
`
`TABLA5
`
`Orthroptera
`
`;MelanqpluS femurrubrum, saltamontes de patas rojas
`
`§Mélanoplus sanguinipes, saltamontes migratoriu
`
`§Mélanoplus differentialis, saltamontes diferencial
`
`TfiBLA6
`
`Diptera
`
`_Hylemya platura,
`
`gusano§MEromyza americana, gusano del;
`
`:de la semilla
`
`itallo del trigo
`
`coarctata, mosca
`parVicornis,§Hylemya
`'Agromy2a
`mjnador de hojas de maiz gbulbo del trigo
`
`del_
`
`-Contarinia
`
`sorghicola,fNeolasioptera
`
`murtfeldtiana,
`
`mosquita del sorgo
`
`Emosquito
`
`de
`
`la
`
`semilla
`
`del
`
`ggirasol
`
`'
`
`'MEyetiola
`
`destructor,E
`
`;m0sca de Hess
`
`Sitodiplosis mosellana,-
`
`mosquito rojo del trigo
`
`15
`000300
`
`

`
`I0
`
`15
`
`25
`
`3!)
`
`35
`
`50
`
`55
`
`ES 2 344 691 T3
`
`TABLA T
`
`_Thysanoptera
`
`Anaphothrips obscurus, trips de la hierba
`
`Frankliniella fusca, trips del tabaco
`
`Thrips tabaci, trips de la Ce-bolla
`
`Sericothrips variabiiis, trips de la soja
`
`I.a e:¢p1'e5i(')n dc Ias secuenciab de zicidn nuc:Ir:ir.:u de la presenle ilwenulfm product: L0x1'11a.~‘.que st: pueden usar um1L1'a
`iuscctos lcpidéptcros, pot cjcmplo, pcro no cxclusivamcmc contra (ltrrinia :mbEr'aIr's (burcnador dcl mafz curopoo),
`Pfrue-Ha .:yJu:;!eJJu (palonlilla dorso dc CIIfi.lI].£i.l1lC), .S'p-odupxzemfrugipcerda (gusano cogollcro), Agrotfs ipsilurt (gusano
`corlador grasienl-0), He'.Ii'r_wv¢'rpa gm (gusann elmern-3, H£.r'r'0rh1'.s' b'fr£'.s'r'en.\‘ (gusann cognllero del lahacn). S'pr)a'(Jp.reI'u
`e.rr'giJa (gu5a11u- soldado de la rcmolucha), Pecrinophora gossjvpieffa [lagarla rusada}, Trichopfumz m' Lgusano falsu
`mcdidor dc la col), Cochylfs hospes (polilla dc bandas dcl girasol} 3' Homeosoma e‘Ee‘r.'Ie‘Hum (pc-Iilla dcl girasolj.
`
`I-in una realimcifm preferida, Ia invencirin abarca una molécula de zicido nucleicn aislada que comprende una
`secuencia de nucleétido-9 que: [a] Iiene un cornplemento que se hibrida com 109. nucleétidos 1981-2367 de SEC. ID
`N”: 1 en 7% dc dodecilsulifato dc 5-ndio (SDS). I\'a.PO-’-I 0.5 M, EDTA 1 mM at 50°C con lavaclo en 0.1 X SSC, SDS
`a1 0.1% at 65"C', 0 (b) as isococlificame con la secuencia dc nucleélidos de (a); 0 (0) time al menos 95% de identidad
`dc sccucncia con SEC. IT). N“: 1; 0 {(1) cmlifica un.-1 sccucllcia dc amilmaicidme quc Licuc -.11 menus 91% (It iu.Ic11Lidad
`de secuencia con SEC. ID. N”: 2, clonde Ia expresién de Ia molécula de aicido nucleico aislada produce actividad de
`::m1lr0I dc inseutos. Cuando Se c:cpIe5a en uu huésped helcrélugo, Ia 11'1c-Iécula dc :ici:l0 uucleico dc SEC. II). N”: 1,
`SEC. ID. N”: 3, SEC. ID. N“: If) 3? SEC. ID. N“: 3] da lugar a 11113 actividad dc control dc inscctos cc-nI.ra flvrrfnfa
`nubifalfs (barrenadrar del Inaiz eumpeo]. Plureua .0-Iosrelia (palomilla do-rso de diamante). Spodopiera frugiperda
`(gusanu L‘uguIIero). Agroris !'p.';iF:Jr: tgusano ::ortar.I(.3I grasienlo), He°Hco1:t=rpa zea (gusanu &:I(JlBl'0). HeIi0rM.s 1:.I'resr:.:=n.s
`(gusano cogollcro dcl tabaco}, Spc;-doprera exfgrra (gusano soldado dc la rcmolacha), Peciinophora gossyp.-‘efla (lagarta
`rosada). Tridropiusia m" (gusano false mcdidor dc Ia col), Cochyfls hospes (polilla dc bandas dcl girasol) y Homeosoma
`elecrelfmn flpolilla del girasol), lo que demueslra que la secuellcia dc nucletilidtas que se expomz an SEC. ID. N“: 1.
`SEC. ID. N”: 3, SEC. ID. N“: 10 }' SEC. ID. N°: 31 as suficienle para dicha uclividad de control dc in5t:»c1-:55.
`
`En una realizacifin, Ia invencién abarca una molécula de aicido nucleic-0 que cornprende Una secuencia de J1ucIeé—
`lidus qut licnc al menos 75% de iden11'dad de Sl:I.'lli':l'lE.'Ii.l con los nucleéolldos 1981-23-67 (It: SEC. ID. N“: I. Preferen-
`tcmmtc, la molécllla dc zirticlo nllclcico aislacla mmpmllclc una sccucncia dc nuclctfiticlos qua: licnc al mcnos 85% dc
`idenlidad de ser.-uencia can log nucleélidos 1981-236? de SEC. IL). N“: I. M515 preferenternente, la mo-lécula de écido
`nu(:Ieic() aislndu cumpreude una secueliciu de nucleélidm; que Liane LLI menus 95% de idenlidad de seuuencia cu-11 Ins
`nuclcélidos 198] -2367 dc SEC. ID. N°: 1. min max prcfcrcmcmcntc, Ia molécula dc acido nuclcico aislada cornprcndc
`una. secucncia dc nuclctfilidus que licnc al menus 99% de idclllidad dc sccucncia. can 105 nuclemidns 1981-2367 dc
`SEC. ID. N“: I. Mu); pleferelllemente, Ia molécula dc aicido nucleico aislada (:01]‘l[J1'i:l"ld|: Ios nuclcétidos 1981-2367 (Ie
`SEC. ID. N”: I 0 SEC. ID. N“: 3.
`
`En 0Lra realizacién, Ia invenciéu abarca una molécula dc asicido nucleico que comprende una secuencia de nucle6li—
`dos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SI:LC. ID. N": 1. M55 prefe1'e11temente, la Inc-lécula de écido
`nucleico aislada cornprende una secuencia de nucleétidos que tiene a1 melms 99% de ide ntidad de secuelacia con SEC.
`ID. N“: I. Muy prcfcncnlcmcntc, Ia malécula dc ficido nuclcico aislada comprcndc Ia sccucncia dc. nuclcétidos quc sc
`cxpone en SE11. ID. N": 1, SEC. ID. N": 3, SEC. ID. N": 10., SEE. ID. N“: 3L 0 SEC. ID. N": 33.
`
`min en otra realizacién, Ia invencién abarca una molécula de aiclclo nucleico comprendida en un alslado de Bacifms
`rhuringiensis seleccimadu dcl grup-:5 que ::0ns.i5lI: en C1674, dcsignado COITIIIJ cl n:g,is11'u:J NRRL B—30556; 3' C536,
`dcsiguado Como cl rcgi5.L1'0 NRRI. B3055’.-'. En una 1'ca.liz:1ci(Sn prcfctida, la invcncién aharca una molécula dc écido
`nucleico comprendida en un clon de E. c-off seleccinnadn del grupo qua consiste en pNO‘-13910, designado como el
`l't‘gI5ll'0 NRRL B30553; pNOV39I1, d6SIgl1&l(l0 ::on1o el regislro NRRL B30552; pNOV3§|0I[3, designado comm el
`1'cgi5l.v0 NRRL B-30555; pNOV3905, clcsiglmdo Como cl rcgisiro NRRL B-30554; y pNOV39l2, dcsignado COIIIO cl
`1wcgisl.uo NRRL B-30551. cuya cxprcsid-11 produce uua toxina