Isothermale in vitro Selektion und
`Amplifikation zur Untersuchung
`von Evolutionsvorg(cid:127)angen
`
`Dissertation
`zur Erlangung des Doktorgrades
`der Fakult(cid:127)at f(cid:127)ur Chemie
`der Ruhr-Universit(cid:127)at Bochum
`
`vorgelegt von
`Sylvia Ehses
`aus Bernkastel-Kues
`
`Sankt Augustin 2005
`
`1
`
`ELIX 1003
`
`

`

`Die Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2002 bis Januar 2005 unter
`Betreuung von Herrn Prof. Dr. G. von Kiedrowski und von Februar 2005
`bis April 2005 unter Betreuung von Herrn Prof. Dr. J. S. McCaskill bei der
`Fraunhofer Gesellschaft e.V. in Sankt Augustin angefertigt.
`
`Teile dieser Arbeit wurden ver(cid:127)o(cid:11)entlicht: S. Ehses, J. Ackermann, J. S.
`McCaskill: Optimization and Design of oligonucleotide setup for Strand
`Displacement Ampli(cid:12)cation. Journal of Biochemical and Biophysical
`Methods, 63(3): 170-86, 2005.
`
`1. Gutachter: Prof. Dr. J. S. McCaskill
`2. Gutachter: Prof. Dr. G. von Kiedrowski
`Dritter Pr(cid:127)ufer: Prof. Dr. W. Schuhmann
`Tag der m(cid:127)undlichen Pr(cid:127)ufung: 08.07.2005
`
`2
`
`

`

`Abstrakt
`
`Hier wird die Entwicklung eines Systems vorgestellt, welches einfache bio-
`chemische in vitro Systeme zur Untersuchung evolutiver Prozesse nutzt. Als
`biochemische Reaktion wird die SDA (Strangverdr(cid:127)angungsampli(cid:12)kation) als
`DNA-Ampli(cid:12)kationsmechanismus weiterentwickelt und an die Anforderun-
`gen eines in vitro Evolutionsexperiments angepasst. Neben eines SELEX-
`Aufbaus beruhend auf Mutation und Selektion von Nukleins(cid:127)auren wird das
`System mit Hinblick auf die Entwicklung eines eigenst(cid:127)andigen evolvierbaren
`Systems bearbeitet. So wird gezeigt, wie sich der Ampli(cid:12)kationsmechanismus
`in Mikro(cid:13)uidikstrukturen steuern l(cid:127)asst { ein Schritt in Richtung komplexer
`Systeme, die helfen, grundlegende Fragen der Evolution zu untersuchen.
`
`3
`
`

`

`Allen, die mich im Laufe der Zeit, in der diese Arbeit entstanden ist,
`begleitet haben, m(cid:127)ochte ich an dieser Stelle Dank sagen.
`
`Als Erstes geb(cid:127)uhrt der Dank Herrn Prof. Dr. John S. McCaskill, unter dessen
`Betreuung ich gelernt habe, den behandelten Themenkomplex zu erfassen
`und zu bearbeiten.
`
`Der Fraunhofer Gesellschaft danke ich f(cid:127)ur die (cid:12)nanzielle und materielle Un-
`terst(cid:127)utzung, die es mir erm(cid:127)oglichte, unter sehr guten Arbeitsbedingungen
`diese Arbeit voranzutreiben.
`
`Ich danke auch Herrn Prof. Dr. G. von Kiedrowski, der neben inhaltlichen
`Diskussionen auch organisatorische Hilfestellungen gab.
`
`Trotz der strukturellen Ver(cid:127)anderungen und der zeitweise unruhigen Arbeits-
`verh(cid:127)altnisse danke ich den einzelnen Mitgliedern der ehemaligen Arbeitsgrup-
`pe BioMIP f(cid:127)ur ihre st(cid:127)andige Hilfsbereitschaft und den sympatischen Umgang.
`
`Meinen Eltern danke ich f(cid:127)ur die unerm(cid:127)udliche Unterst(cid:127)utzung w(cid:127)ahrend dieser
`Jahre. Des Weiteren danke ich Stefan, dessen langj(cid:127)ahrige Begleitung und
`auch Geduld, vieles einfacher gestaltete. Au(cid:25)erdem danke ich Robert f(cid:127)ur die
`manchmal ern(cid:127)uchternden aber auch animierenden Worte.
`
`Ich m(cid:127)ochte auch nicht missen, noch so vielen zu danken, die mich best(cid:127)arkt
`haben, indem sie einfach daran glaubten, dass dieses Projekt endlich ist. . .
`
`4
`
`

`

`Inhaltsverzeichnis
`
`1 Einleitung
`1.1 Molekulare Evolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`1.1.1
`In vitro Selektion und SELEX . . . . . . . . . . . .
`1.1.2 Molekulare Fitnesslandschaften . . . . . . . . . . .
`Isothermale Ampli(cid:12)kationsverfahren . . . . . . . . . . . . .
`1.2.1
`Strangverdr(cid:127)angungsampli(cid:12)kation . . . . . . . . . .
`Inhalt der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`
`1.2
`
`1.3
`
`2 Material und Methoden
`2.1 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.1.1 Chemikalien, Enzyme, Standards
`. . . . . . . . . .
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.1.2 Ger(cid:127)ate
`2.1.3
`Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.1.4 Oligonukleotide, Plasmide und Bakterienst(cid:127)amme . .
`(cid:127)Ubersicht Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . .
`2.1.5
`2.1.6 Bakterienst(cid:127)amme und Plasmide . . . . . . . . . . .
`2.1.7 H(cid:127)au(cid:12)g verwendete Pu(cid:11)erl(cid:127)osungen, Medien und Plat-
`ten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.2 Grundlegende molekularbiologische Methoden . . . . . . .
`2.2.1 Konzentrationsbestimmung von Oligonukleotiden .
`2.2.2 DNA-Pr(cid:127)aparation und Reinigung von Nukleins(cid:127)aurel(cid:127)o-
`sungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.2.3 Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.2.4 Klonierung der Ampli(cid:12)kationsprodukte und Transfor-
`mation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.2.5 Polymerase-Kettenreaktion
`. . . . . . . . . . . . .
`2.3 SDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.3.1
`Standard SDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.3.2 Nicking SDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.3.3 Elongation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.3.4 Experimentelle Optimierung . . . . . . . . . . . . .
`
`3
`
`13
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`36
`38
`38
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`
`5
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`

`

`4
`
`INHALTSVERZEICHNIS
`
`. . .
`2.3.5 Optimierung des Templat- und Primerdesigns
`2.3.6
`S(cid:127)attigbare Inhibierung durch Einsatz von Additiven
`2.4 Charakterisierung von Molecular Beacons . . . . . . . . . .
`2.4.1 Bestimmung des Signal-Hintergrund-Verh(cid:127)altnisses .
`2.4.2 Aufzeichnung des thermalen Denaturierungspro(cid:12)ls .
`2.4.3 Erstellung eines Phasendiagramms
`. . . . . . . . .
`2.5 Selektions-Ampli(cid:12)kations-Zyklus . . . . . . . . . . . . . . .
`2.5.1
`Immobilisierung von DNA Oligonukleotiden auf Mi-
`kropartikeln
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.5.2 Bestimmung der Kopplungse(cid:14)zienz
`. . . . . . . .
`2.5.3 Experimenteller Aufbau . . . . . . . . . . . . . . .
`2.5.4 Bestimmung der Bindungsenergie . . . . . . . . . .
`2.6 SDA in Mikrostrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.6.1
`SDA-Modul
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.6.2
`SDA in Mikro(cid:13)uidikstrukturen: Fanreaktor
`. . . .
`
`3.1.3
`
`3 Ergebnisse
`3.1 Strangverdr(cid:127)angungsampli(cid:12)kation . . . . . . . . . . . . . .
`3.1.1 Beschreibung des Systems und experimentelle Opti-
`mierung der Reaktionsbedingungen . . . . . . . . .
`3.1.2 Entwicklung eines Algorithmus zur Optimierung des
`Oligonukleotiddesigns
`. . . . . . . . . . . . . . . .
`S(cid:127)attigbare Inhibierung als Mittel zur Erzeugung nicht-
`linearer Reaktionskinetiken . . . . . . . . . . . . . .
`3.2 Bindungsstudien des Molecular Beacons MB:A11 . . . . .
`3.2.1 Hybridisierungskinetik und Thermodynamik . . . .
`3.2.2 Hybridisierungsexperimente in Sequenzpools
`. . . .
`3.3 Selektions-Ampli(cid:12)kations-Zyklus . . . . . . . . . . . . . . .
`3.3.1
`Selektion auf einer Sonde . . . . . . . . . . . . . . .
`3.3.2
`Selektion auf zwei Sonden . . . . . . . . . . . . . .
`3.4 SDA in Mikrostrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.4.1
`SDA-Modul
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.4.2
`SDA im Fanreaktor: R(cid:127)aumlich/zeitlich aufgel(cid:127)oste Dar-
`stellung der SDA-Reaktion unter Flussbedingungen
`
`4 Diskussion
`4.1 SDA als (cid:13)exibles Replikationswerkzeug . . . . . . . . . . .
`4.2 Selektion (cid:127)uber DNA-Hybridisierung . . . . . . . . . . . . .
`4.3 SDA in Mikro(cid:13)uidiksystemen . . . . . . . . . . . . . . . .
`4.4 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`
`39
`40
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`42
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`109
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`115
`116
`117
`120
`122
`
`6
`
`

`

`INHALTSVERZEICHNIS
`
`A Sequenzdaten der 2-Sonden-Selektion
`A.1 Runde 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`A.2 Runde 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`A.3 Runde 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`A.4 Runde 10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`A.5 Runde 12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`A.6 Runde 14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`A.7 Runde 16 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`
`5
`
`I
`I
`II
`IV
`VI
`VII
`IX
`X
`
`B Bindungsenergien der 2-Sonden Selektion
`
`XIII
`
`XXI
`C Algorithmen
`XXI
`C.1 Optimierung des Oligonukleotiddesigns . . . . . . . . . . .
`C.2 Bestimmung von Bindungsenergien . . . . . . . . . . . . . XXV
`C.3 Beschreibung der Thermodynamik von MB:A11 . . . . . . XXX
`C.4 Modell zur Beschreibung von Delektionsereignissen . . . . XXXII
`
`D Abk(cid:127)urzungsverzeichnis
`
`E Verwendete Formelzeichen
`
`Literatur
`
`XXXV
`
`XXXVII
`
`XXXVII
`
`7
`
`

`

`6
`
`INHALTSVERZEICHNIS
`INHALTSVERZEICHNIS
`
`8
`
`

`

`Abbildungsverzeichnis
`
`Fitnesslandschaften\. . . . . . .
`1.1 Bildliche Darstellung von
`"
`1.2 Grundlegender Mechanismus von SDA unter Verwendung der
`exo(cid:0)DNA Polymerase und des Restriktionsenzyms BsoBI.
`
`2.1 Klonierungsvektor pCR2.1-TOPO . . . . . . . . . . . . . .
`2.2 SDA Oligonukleotid Aufbau. . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.3 Einsatz der Partition Function zur Suche nach m(cid:127)oglichen un-
`spezi(cid:12)schen Hybridisierung- und Elongationsreaktionen. . .
`. .
`2.4 Phasen(cid:127)uberg(cid:127)ange in L(cid:127)osungen mit Molecular Beacons.
`2.5 SDA-Modul zur Echtzeitdetektion der SDA-Reaktion in Mi-
`krostrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.6 Aufbau der Tandemoptik zur Beobachtung von Reaktionen in
`Mikrostrukturen.
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.7 Komponenten der Tandem-Optik.
`. . . . . . . . . . . . . .
`2.8 Skizze des Fanreaktors zur Durchf(cid:127)uhrung von SDA unter Fluss-
`bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.9 Mikroskop-Aufbau zur Detektion der SDA-Reaktion im Fan-
`reaktor unter Flussbedingungen.
`. . . . . . . . . . . . . .
`
`3.1 Standard und Nicking SDA in Abh(cid:127)angigkeit von der Reakti-
`onstemperatur.
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.2 SDA in Abh(cid:127)angigkeit von der Konzentration an Magnesiumio-
`nen.
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.3 Enzymreihe: Abh(cid:127)angigkeit der Nicking SDA von der Konzen-
`tration an Polymerase exo(cid:0)Bst und dem Restriktionsenzym
`N.BstNBI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.4 Echtzeitdetektion der SDA auf tSDAI und Anpassung der
`Messdaten an Modelle exponentiellen und logistischen Wachs-
`tums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.5 Asymmetrische SDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`
`18
`
`19
`
`30
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`
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`62
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`63
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`
`7
`
`9
`
`

`

`8
`
`ABBILDUNGSVERZEICHNIS
`
`3.6 Analyse der SDA Reaktionsprodukte bei unterschiedlichen Start-
`konzentrationen an Templat. . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.7 Elongationsversuch zur Analyse von Nebenprodukten aufgrund
`von Primerdimerisisierung. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.8 Ein(cid:13)uss von Additiven (hp-DNA, Heparin und PolyC) auf die
`SDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.9 Primerverd(cid:127)unnungsreihe.
`3.10 Flussdiagramm des SDA-Optimierungsalgorithmus.
`. . . .
`3.11 Analyse der SDA-Reaktionsprodukte des optimierten Oligo-
`designs mit der Zielsequenz tSDAmin5.
`. . . . . . . . . . .
`3.12 Inhibierung der SDA Reaktion SDAI mit TOTO-1 bei kon-
`stanter Templatkonzentration.
`. . . . . . . . . . . . . . . .
`3.13 Inhibierung der SDA Reaktion mit TOTO-1 bei unterschied-
`licher initialer Templatkonzentration.
`. . . . . . . . . . . .
`3.14 Inhibierung der SDA Reaktion mit TOTO-1 bei unterschied-
`licher Farbsto(cid:11)konzentration im SDA-Modul
`. . . . . . . .
`3.15 Inhibierung der SDA mit PNA-Oligonukleotiden in Abh(cid:127)angigkeit
`von der Templatkonzentration tSDAI. . . . . . . . . . . . .
`3.16 Ein(cid:13)uss der PNA Oligonukleotide im SDA-Reaktionsverlauf.
`3.17 Darstellung des Molecular Beacons MB:A11. . . . . . . . .
`3.18 Bestimmung der Schmelztemperaturen der Zielsequenzen mit
`. . .
`bekannter Basensequenz (cid:127)uber die Partition Function.
`3.19 Denaturierungspro(cid:12)le des Molecular Beacons MB:A11 im Gleich-
`gewicht mit der komplement(cid:127)aren Zielsequenz und in Abh(cid:127)angigkeit
`von der Konzentration der Zielsequenz.
`. . . . . . . . . . .
`3.20 Bestimmung thermodynamischer Parameter
`. . . . . . . .
`3.21 Freie Energie der drei Phasen der Molecular Beacon-L(cid:127)osung
`MB:A11 im Gleichgewicht mit der komplement(cid:127)aren Sequenz
`complA11. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.22 Titration von Zielsequenzen unterschiedlicher Fehlpaarung mit
`dem Molecular Beacon MB:A11. . . . . . . . . . . . . . . .
`3.23 Darstellung der Verteilung der Schmelztemperaturen des Se-
`quenzpools in Abh(cid:127)angigkeit von der Anzahl der Fehlpaarun-
`gen
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.24 Schmelzkurve des Molecular Beacons MB:A11 in Gegenwart
`verschiedener Zielsequenzen mit Fehlpaarungen . . . . . .
`3.25 Vergleich der gemessenen Schmelzkurve des Molecular Bea-
`cons MB:A11 mit dem Sequenzpool Y=T/C=91/9 als Zielse-
`quenz.
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.26 Bestimmung der Schmelztemperatur (cid:127)uber die Partition Func-
`tion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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`ABBILDUNGSVERZEICHNIS
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`9
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`93
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`95
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`
`98
`
`99
`
`101
`
`3.27 Vergleich der berechneten und experimentell bestimmten Schmelz-
`punkte des Molecular Beacons MB:A11 bei Hybridisierung
`mit unterschiedlichen Zielsequenzen. . . . . . . . . . . . . .
`3.28 Eichreihe mit pSDAw2(6.0) zur Quanti(cid:12)zierung der Hybri-
`disierungskapazit(cid:127)at von micromer-M Partikel gekoppelt mit
`I1R(SDA)TIVTV-NH2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.29 Alignment der sequenzierten Produkte aus der 1-Sonden-Selektion
`nach f(cid:127)unf (V1{V9) und sechs Runden (VI1{VI10) mit tSDAII
`als Startpool. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.30 Darstellung der Sondenbindungsregionen S1 und S2 auf tS-
`DAI.
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.31 Eichreihe mit V5-0rR6G und V4-1R6G zur Quanti(cid:12)zierung
`der Hybridisierungskapazit(cid:127)at von M-PVA Mikropartikel ge-
`koppelt mit Im5-0r und Im4-1r
`. . . . . . . . . . . . . . .
`3.32 Alignment der sequenzierten Selektionsprodukte nach 16 Run-
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`den f(cid:127)ur tSDAI.
`3.33 Alignment der sequenzierten Produkte des seriellen Transfers
`102
`. . . . . . . . . . . . . . . . .
`nach f(cid:127)unf und acht Runden.
`3.34 Alignment der sequenzierten Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte
`nach 16 Runden bei Ampli(cid:12)kation der Selektionsprodukte mit
`PCR statt SDA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.35 Alignment der sequenzierten Selektionsprodukte nach 16 Run-
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`den f(cid:127)ur tSDAII.
`3.36 Modell zur Beschreibung des Anteils der Sequenzen ohne De-
`letion in Abh(cid:127)angigkeit vom Selektionsvorteil. . . . . . . . .
`3.37 Darstellung der Molecular Beacons zur Charakterisierung der
`Selektionsprodukte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.38 Einsatz von Molecular Beacons zur Beobachtung der (cid:127)Anderung
`. . . . . .
`der Bindungsa(cid:14)nit(cid:127)at in SELEX-Experimenten.
`3.39 Beschreibung der SDA-Reaktion im SDA-Modul. . . . . . .
`3.40 Produktkontrolle der SDA Reaktion im Fanreaktor
`. . . .
`3.41 SDA im Fanreaktor in Abh(cid:127)angigkeit von der Flussgeschwin-
`digkeit. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.42 Detektion der SDA auf tSDAI in Echtzeit und Anpassung der
`Messdaten an Modelle logistischen und exponentiellen Wachs-
`tums. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`
`102
`
`103
`
`106
`
`107
`
`108
`110
`110
`
`111
`
`113
`
`A.1 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 4
`Runden bei Start mit Templat T(SDA)I.
`. . . . . . . . . .
`A.2 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 4
`Runden bei Start mit dem Sequenzpool T(SDA)II.
`. . . .
`
`I
`
`II
`
`11
`
`

`

`10
`
`ABBILDUNGSVERZEICHNIS
`
`A.3 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 6
`Runden bei Start mit Templat T(SDA)I .
`. . . . . . . . .
`A.4 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 6
`Runden bei Start mit dem Sequenzpool T(SDA)II.
`. . . .
`A.5 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 8
`Runden bei Start mit Templat T(SDA)I.
`. . . . . . . . . .
`A.6 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 8
`Runden bei Start mit dem Sequenzpool T(SDA)II.
`. . . .
`A.7 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 10
`Runden bei Start mit Templat T(SDA)I .
`. . . . . . . . .
`A.8 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 10
`Runden bei Start mit dem Sequenzpool T(SDA)II.
`. . . .
`A.9 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 12
`Runden bei Start mit Templat T(SDA)I .
`. . . . . . . . .
`A.10 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 12
`Runden bei Start mit dem Sequenzpool T(SDA)II.
`. . . .
`A.11 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 14
`Runden bei Start mit Templat T(SDA)I .
`. . . . . . . . .
`A.12 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 14
`Runden bei Start mit dem Sequenzpool T(SDA)II.
`. . . .
`A.13 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 16
`Runden bei Start mit Templat T(SDA)I.
`. . . . . . . . . .
`A.14 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 16
`Runden bei Start mit dem Sequenzpool T(SDA)II.
`. . . .
`A.15 Sequenzierung der Selektions-/Ampli(cid:12)kationsprodukte nach 16
`Runden bei Start mit Templat T(SDA)I bzw. dem Sequenz-
`pool T(SDA)II jedoch bei Ampli(cid:12)kation der Selektionsproduk-
`te nach Selektionsrunde 16 mit PCR statt SDA.
`. . . . . .
`
`II
`
`III
`
`IV
`
`V
`
`VI
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`VI
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`VII
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`VIII
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`IX
`
`IX
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`X
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`XI
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`XII
`
`12
`
`

`

`Tabellenverzeichnis
`
`2.6 Einstellungen zur Echtzeitdetektion . . . . . . . . . . . . .
`2.7 Verwendete Enzyme.
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`2.8 Pipettierschema SDA unter Flussbedingungen im Fanreaktor
`
`3.1 Vergleich der Bindung von Ampli(cid:12)kationsprodukt auf tSDAI
`nach asymmetrischer und symmetrischer SDA und nach Hit-
`zedenaturierung.
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.2 Oligo-Designs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.3 Sequenzierte Produkte der DNA-Leiter. . . . . . . . . . . .
`3.4 Oligonukleotidsequenz des Molecular Beacons MB:A11 und
`der eingesetzten Zielsequenzen mit unterschiedlichen Fehlpaa-
`rungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`3.5 Darstellung von Sequenzpools anhand Binomialverteilung .
`3.6 Vergleich berechnete und gemessene Schmelztemperaturen des
`Molecular Beacons an verschiedene Zielsequenzen.
`. . . . .
`3.7 Bestimmung der Hybridisierungskapazit(cid:127)at von micromer-M Par-
`tikel gekoppelt mit I1R(SDA)TIVTV-NH2. . . . . . . . . .
`3.8 Selektionsschritte der 1-Sondenselektion.
`. . . . . . . . . .
`3.9 Beschreibung der selektierten Sequenzen aus den 1-Sonden-
`Versuchen nach Runde V und VI
`. . . . . . . . . . . . . .
`3.10 Bestimmung der Hybridisierungskapazit(cid:127)at von M-PVA Parti-
`kel gekoppelt mit dem Oligonukleotid Im4-1r bzw. Im5-0r.
`3.11 Selektionsschritte der 2-Sondenselektion.
`. . . . . . . . . .
`
`37
`39
`56
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`64
`66
`69
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`81
`82
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`92
`
`94
`95
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`97
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`99
`100
`
`B.1 Berechnung der Bindungsenergie an die Sonden S1 und S2
`nach den Selektions-/Ampli(cid:12)kationsexperimenten mit der Start-
`sequenz T(SDA)I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`XIII
`B.2 Berechnung der Bindungsenergie an die Sonden S1 und S2
`nach den Selektions-/Ampli(cid:12)kationsexperimenten mit dem Start-
`pool T(SDA)II
`. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
`XVI
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`11
`
`13
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`

`

`12
`12
`
`TABELLENVERZEICHNIS
`TABELLENVERZEICHNIS
`
`14
`
`14
`
`

`

`Kapitel 1
`
`Einleitung
`
`Von Charles Darwin wurde 1848 die Bedeutung der Evolution in seinem Buch
`On the origin of species by natural selection [27] erstmalig dargestellt. Der
`Erfolg und die E(cid:14)zienz in der Darwinschen Evolutionstheorie basiert auf der
`Unterscheidung von Genotyp und Ph(cid:127)anotyp, wobei Ersteres der Variation,
`Letzteres der Selektion ausgesetzt ist.
`In der Populationsgenetik wird die Dynamik der Evolution als Prozess im
`Sequenzraum des Genotyps dargestellt. Zur Beschreibung des Ph(cid:127)anotyps be-
`dient man sich empirischer Parameter. Die Optimierung ist ein Prozess im
`Sequenzraum der Genotypen. Ohne jedoch den Ph(cid:127)anotyp zu ber(cid:127)ucksichtigen,
`bleibt die Beschreibung evolutiver Prozesse unvollst(cid:127)andig.
`Evolution(cid:127)are Optimierung in sich asexuell vermehrenden Populationen folgt
`der Darwinschen Evolutionstheorie und wird durch das Zusammenspiel von
`zwei Prozessen mit gegens(cid:127)atzlichen Ein(cid:13)uss auf die genetische Heterogenit(cid:127)at
`determiniert: zum einen erh(cid:127)ohen Mutationen die Diversit(cid:127)at der Genotypen,
`zum anderen wird (cid:127)uber Selektion die Diversit(cid:127)at von Ph(cid:127)anotypen verringert.
`Auf den ersten Blick erscheint die Entkopplung des Ziels einer Mutation von
`der Selektion unvorteilhaft. Eine vorteilhafte Mutation tritt nicht h(cid:127)au(cid:12)ger
`auf, weil sie bessere Chancen hat, selektiert zu werden. Jedoch gew(cid:127)ahrleistet
`Genotyp-Ph(cid:127)anotyp Dichotomie in der Natur die zuf(cid:127)allige Wanderung auf der
`Fitnesslandschaft mit dem E(cid:11)ekt der Optimierung.
`Wesenheiten\, und mit einigen
`Genotyp und Ph(cid:127)anotyp sind verschiedene
`"
`wenigen Ausnahmen ist es unm(cid:127)oglich, (cid:127)Anderungen ph(cid:127)anotypischer Eigen-
`schaften bekannten Modi(cid:12)kationen der DNA Sequenz des Genotyps zuzuord-
`nen. Der Metabolismus ist zu komplex, um ihn von der genomischen DNA
`Sequenz abzuleiten.
`Verschiedene Strategien wurden verfolgt, um hinreichend einfache Systeme
`zu (cid:12)nden, die das Studium von Evolutionsprozessen erm(cid:127)oglichen. So wurden
`
`13
`
`15
`
`

`

`14
`
`KAPITEL 1. EINLEITUNG
`
`von Lenski und Mitarbeitern Experimente unter kontrollierten Wachstums-
`bedingungen mit Bakterienkulturen im Chemostaten durchgef(cid:127)uhrt [66, 67].
`Jedoch sind Bakterien zu komplex, um den Verlauf von Evolutionsexperi-
`menten auf molekularer Ebene interpretieren zu k(cid:127)onnen.
`Der einfachste Fall eines evolutiven Prozesses in vitro, die Optimierung von
`Ribozymen, RNA-Molek(cid:127)ule, die sowohl Genotyp (RNA-Sequenz) als auch
`Ph(cid:127)anotyp (RNA-Struktur) darstellen, konnte erfolgreich beschrieben werden.
`Joyce entwickelte zusammen mit seinen Mitarbeitern ein System, welches
`die kontinuierliche Beschreibung eines solchen Evolutionsprozesses erlaubt
`[80]. Das System verbindet neu erworbene Funktionalit(cid:127)at mit Selektion und
`Ampli(cid:12)kation.
`
`1.1 Molekulare Evolution
`
`Biochemische Reaktionen wie die Nukleins(cid:127)aureampli(cid:12)kation erm(cid:127)oglichen die
`Untersuchung makroevolutiver Prozesse auf der
`Laborzeitskala\. Eine bio-
`"
`chemisch gelenkte Evolution demonstrierten Ende der 60er Jahre erstmals
`Spiegelmann und seine Mitarbeiter an einer Replikase des Q(cid:12) Bakteriopha-
`gen [84]. Hierbei konnten RNA-Molek(cid:127)ule im Reagenzglas vermehrt werden
`und nach hinreichend vielen Generationen Evolutionsph(cid:127)anomene im Dar-
`winschen Sinne der Selektion und evolution(cid:127)are Anpassung an die Umwelt
`beobachtet werden. Dabei wurde belegt, dass die Evolutionsprinzipien nicht
`an zellul(cid:127)ares Leben gebunden sind. Vielmehr gen(cid:127)ugen Molek(cid:127)ule, die zur Ver-
`mehrung und Mutation f(cid:127)ahig sind. Die in vitro Evolution der RNA-Molek(cid:127)ule
`spiegelt die Evolution im Zeitra(cid:11)er wieder. Untersuchungen zu den Mecha-
`nismen der Evolution mit Bezug zur chemischen Kinetik wurden von Bieb-
`richer et al. durchgef(cid:127)uhrt [12].
`
`1.1.1
`
`In vitro Selektion und SELEX
`
`Molekulare Evolution erm(cid:127)oglicht es, Nukleins(cid:127)auren mit katalytischer Akti-
`vit(cid:127)at oder bestimmten Bindungseigenschaften zu isolieren. In vitro Selek-
`tionsmethoden wie SELEX (systematic evolution of ligands by exponential
`ampli(cid:12)cation) nutzen gro(cid:25)e Populationen an Zufallssequenzen von RNA oder
`DNA als Startmaterial zur Selektion bestimmter funktioneller Molek(cid:127)ule [36,
`56]. Seit der Isolierung der Reversen Transkriptase und der Er(cid:12)ndung der
`Polymerasekettenreaktion in den 90er Jahren ist es m(cid:127)oglich, beinahe jede
`Nukleins(cid:127)aure in vitro zu ampli(cid:12)zieren und somit in vitro Selektion und ge-
`richtete Evolution zu kombinieren, um den Sequenzraum f(cid:127)ur hoch spezielle
`
`16
`
`

`

`1.1. MOLEKULARE EVOLUTION
`
`15
`
`RNA Sequenzen zu durchsuchen [36, 121]. Liganden, die aus in vitro Selek-
`tionen stammen, werden als Aptamere bezeichnet. Im Allgemeinen werden
`Aptamere nach folgendem Schema gewonnen: Ein DNA-Pool wird chemisch
`synthetisiert, wobei eine Zufalls- oder mutagenisierte Sequenz durch konstan-
`te Sequenzen und einem T7 Polymerase Promoter am 5’ Ende begrenzt wird.
`Die DNA wird (cid:127)uber einige PCR-Zyklen ampli(cid:12)ziert und anschlie(cid:25)end in vi-
`tro transkribiert, um den RNA-Pool herzustellen. Die RNA Molek(cid:127)ule werden
`nun aufgrund ihrer Eigenschaften, wie der Bindung an eine A(cid:14)nit(cid:127)atss(cid:127)aule,
`die mit dem entsprechenden Zielmolek(cid:127)ul beladen ist, getrennt. Die gebunde-
`nen Molek(cid:127)ule werden eluiert, revers transkribiert, ampli(cid:12)ziert, transkribiert
`und in einen erneuten Zyklus eingespeist. Mit jeder weiteren Runde erh(cid:127)oht
`sich das Verh(cid:127)altnis von aktiven zu inaktiven Sequenzen. Nach f(cid:127)unf bis zehn
`Runden setzt sich meist eine Sequenz durch. Neben RNA Molek(cid:127)ulen k(cid:127)onnen
`auch einzel- oder doppelstr(cid:127)angige DNA Molek(cid:127)ule selektiert werden [118, 37].
`(cid:127)Uber in vitro Selektion wurden Aptamere f(cid:127)ur Ionen [24], kleine Molek(cid:127)ule [36],
`Peptide [89], Proteine [121], Organellen [98], Viren [91] und sogar f(cid:127)ur Zellen
`[86] gefunden.
`Eine Variante der Aptamer-Selektionsstrategie wird zur Isolierung katalytisch
`aktiver Nukleins(cid:127)auresequenzen eingesetzt. Aufbauend auf bekannten und be-
`schriebenen Ribozymen wurden solche Techniken zur Herstellung neuer Ri-
`bozyme, aber auch zur Aufkl(cid:127)arung von Ribozymstrukturen, katalytischen
`Mechanismen und Faltungswegen genutzt [82, 46, 10, 8, 65, 20]. Daneben
`wurden in vitro Selektionsstrategien auf den Bereich der Polypeptide erwei-
`tert. Das Problem der Kopplung zwischen Ph(cid:127)anotyp und Genotyp kann (cid:127)uber
`Techniken wie Phagen [112] und Ribozym Display [75] oder der Fusion von
`mRNA und Protein (cid:127)uber Puromycin [100] gel(cid:127)ost werden.
`
`1.1.2 Theoretische Beschreibung molekularer Fitness-
`landschaften
`
`Zur Optimierung der Suchprozesse nach Molek(cid:127)ulen, z. B. Aptameren, k(cid:127)onnen
`Evolutionsmodelle wie Fitnesslandschaften und Sequenzr(cid:127)aume eingesetzt wer-
`den. Die verwendeten Suchstrategien beruhen vornehmlich auf pooling Schrit-
`ten, Mutation und Selektion sowie Rekombination.
`Ausgehend von der chemischen Reaktionskinetik beschreibt Eigen [33] Re-
`plikation und Mutation als parallele chemische Prozesse. Die Replikations-
`und Mutationskinetik wird in einem abstrakten Raum der Nukleotidsequen-
`zen, dem Sequenzraum, dargestellt. Statische Mutantenverteilungen in Po-
`pulationen (Quasispezies) bilden das genetische Reservoir bei der asexuellen
`Vermehrung [32].
`
`17
`
`

`

`16
`
`KAPITEL 1. EINLEITUNG
`
`Dabei wurde gezeigt, dass die Mutationsrate nicht beliebig gesteigert wer-
`den kann. Es gibt eine kritische Fehlerrate (Fehlerschwelle), oberhalb derer
`so viele neue Mutanten gebildet werden, dass der reproduktive Erfolg oder
`Fitness der besten, der Mastersequenz, nicht ausreicht, um ihr (cid:127)Uberleben
`in der folgenden Generation zu sichern bzw. um Zufallsverluste (Eigensche
`Flie(cid:25)verluste) auszugleichen. Die Fehlerschwelle wird (cid:127)uber die minimale Ge-
`nauigkeit
`
`qmin = nr 1
`
`(cid:27)m
`
`(1.1)
`
`mit der Genauigkeit der Replikation q (Anteil der korrekt eingebauten Nu-
`kleotide) und der Fehlerrate p = 1(cid:0)q berechnet. Die so genannte Superiorit(cid:127)at
`der Mastersequenz (cid:27)m beinhaltet den Quotienten aus dem Fitnesswert der
`Mastersequenz (km) und dem Rest der Population (k). Je mehr die Master-
`sequenz den anderen Sequenzen in der Population (cid:127)uberlegen ist, umso mehr
`Fehler k(cid:127)onnen toleriert werden.
`Adaptive Landschaften wurden durch Wright [138] bereits 1932 als Werk-
`zeug der Visualisierung evolutiver Antriebskr(cid:127)afte eingef(cid:127)uhrt. In einer sol-
`chen Landschaft stellt jeder Genotyp einen Punkt im multidimensionalen
`Raum dar, dessen Ausdehnung seinem ph(cid:127)anotypischen Wert entspricht. Die-
`ser ph(cid:127)anotypische Wert wird h(cid:127)au(cid:12)g der Fitness gleichgesetzt, sodass h(cid:127)ohere
`Extrema Genotypen mit einem evolutiven Vorteil darstellen und somit eher
`selektiert werden. Im Fall von Protein- oder Nukleins(cid:127)auresequenzen unter
`Selektion, hat eine solche Landschaft so viele Dimensionen wie die Sequenz
`Nukleotide enth(cid:127)alt.
`Bei einer RNA oder DNA Population unter Selektionsdruck in vitro ist die
`Mutationsrate entscheidend daf(cid:127)ur, ob es sich vornehmlich um ein Selektions-
`oder Evolutionsexperiment handelt [17]. Reine Selektion schlie(cid:25)t jede Se-
`quenz aus, die nicht im Startpool vorhanden ist. On-line Mutagenese erlaubt
`die Durchsuchung eines gr(cid:127)o(cid:25)eren Sequenzraumes, so lange die Mutationsrate
`nicht die Eigensche Fehlerschwelle (cid:127)ubersteigt [29].
`Entscheidend f(cid:127)ur den Evolutionsablauf in vitro ist die Form der adaptiven
`Landschaft. Die Ober(cid:13)(cid:127)ache ist sanft, wenn (cid:127)ahnliche Genotypen (cid:127)ahnliche Fit-
`nesswerte aufweisen und die Landschaft nur wenige Extrema aufweist. Stellt
`sich die Landschaft zerkl(cid:127)uftet dar, so k(cid:127)onnen zwei Sequenzen, die sich nur
`in wenigen Nukleotiden unterscheiden, v(cid:127)ollig verschiedene Fitnesswerte be-
`sitzen. Es bestehen viele Fitnessoptima [57] (s. Abbildung 1.1). Der Verlauf
`der Landschaft kann (cid:127)uber die Korrelationsfunktion [57, 40]
`
`(cid:26)(d) = 1 (cid:0)
`
`ave([f (1) (cid:0) f (2)]2
`d)
`ave([f (x) (cid:0) f (y)]2)
`
`(1.2)
`
`18
`
`

`

`1.2. ISOTHERMALE AMPLIFIKATIONSVERFAHREN
`
`17
`
`quanti(cid:12)ziert werden. Der Z(cid:127)ahler des Subtrahenden stellt das Mittel des Qua-
`drats der Fitnesswerte des Paares mit dem Genotyp 1 und 2 dar, die im Se-
`quenzraum durch d Mutationsstufen voneinander getrennt sind (Hamming
`Abstand). Der Nenner unterscheidet sich nur dadurch, dass hier die Geno-
`typen durch einen
`zuf(cid:127)alligen\ Abstand (0,75 pro Nukleotid) voneinander
`"
`entfernt sind. In einer sanften Landschaft ist der Z(cid:127)ahler im Vergleich zum
`Nenner relativ klein, sodass die Ph(cid:127)anotypen hoch korreliert sind. Der Selek-
`tionsgradient ist schwach und im Zuge der Replikation sind viele L(cid:127)osungen zu
`erwarten. In rauen Landschaften hingegen sind die Ph(cid:127)anotypen wenig kor-
`reliert und (cid:127)ahnliche Genotypen k(cid:127)onnen sehr unterschiedliche Fitnesswerte
`aufweisen. Der Selektionsgradient ist hier sehr stark, sodass lokale Fitness-
`optima nach jedem Replikationsereignis erreicht werden sollten.
`
`1.2 Isothermale Ampli(cid:12)kationsverfahren
`
`Ampli(cid:12)kationsverfahren wie die Q(cid:12)-Reaktion [115] oder die self-sustained se-
`quence Replikation (3SR) [18] erm(cid:127)oglichen das Studium evolutiver Prozesse
`auf molekularen Niveau. Neben biochemischen Ampli(cid:12)kationsmechanismen
`von Oligonukleotiden sind auch chemische Replikationssysteme [71] bekannt.
`Isothermale Ampli(cid:12)kationssysteme erlauben im Gegensatz zur (cid:127)uber Tem-
`peraturstufen synchronisierten PCR [103] eine kontinuierlich fortschreitende
`Reaktion und somit Evolution (zum (cid:127)Uberblick s. z. B. [108]). Im Hinblick
`auf den Einsatz und Kontrolle in Mikro(cid:13)uidikstrukturen liegt ein weiterer
`Vorteil darin, dass es nicht zu thermisch bedingten Volumen(cid:127)anderungen und
`Konvektion kommt.
`
`1.2.1 Strangverdr(cid:127)angungsampli(cid:12)kation
`
`Strangverdr(cid:127)angungsampli(cid:12)kation1 (SDA) stellt einen bedeutenden isother-
`malen Mechanismus zur exponentiellen DNA-Ampli(cid:12)kation dar [127, 129].
`Insbesondere durch den Einsatz thermostabiler Enzyme und die dadurch
`erh(cid:127)ohte Stringenz konnte sich der Mechanismus erfolgreich unter anderem
`im Bereich der Diagnostik von Mycobakterien [113] aber auch zum Einsatz
`bei der Untersuchung molekularer Evolutionsstudien [131, 130] etablieren.
`
`SDA basiert auf dem kombinierten Einsatz zweier Enz