(12) NACH DEM VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ZUSAMMENARBEIT AUF DEM GEBIET DES
`PATENTWESENS(PCT) VEROFFENTLICHTE INTERNATIONALE ANMELDUNG
`
` APO CARAACA
`
`(10) Internationale Veréffentlichungsnummer
`WO 2007/096387 Al
`
`(19) Weltorganisationfiir geistiges Eigentum
`Internationales Biiro
`
`(43) Internationales Veréffentlichungsdatum
`30. August 2007 (30.08.2007)
`
`(51) Internationale Patentklassifikation:
`CI2N 15/82 (2006.01)
`
`(21) Internationales Aktenzeichen:
`
`PCT/EP2007/05 1675
`
`(22) Internationales Anmeldedatum:
`21. Februar 2007 (21.02.2007)
`
`(25) Einreichungssprache:
`
`(26) Verdéffentlichungssprache:
`
`(30) Angabenzur Prioritat:
`10 2006 008 030.0
`
`Deutsch
`
`Deutsch
`
`06120309.7
`
`21. Februar 2006 (21.02.2006)
`7. September 2006 (07.09.2006)
`
`DE
`EP
`
`(71) Anmelder (fiir alle Bestimmungsstaaten mit Ausnahme
`von US): BASF PLANT SCIENCE[DE/DE]; BPS - A30,
`67056 Ludwigshafen (DE).
`
`(72)
`(75)
`
`Erfinder; und
`(nur fiir US): CIRPUS, Petra
`Erfinder/Anmelder
`[DE/DE]; Landteilstrasse 12, 68163 Mannheim (DE).
`BAUER, Jérg [DE/DE]; Maxburgstrasse 6, 67117 Lim-
`burgerhof (DE). QIU, Xiao [CA/CA]; 403 Kendardine
`Road, Saskatoon, Saskatchewan S7N 3S5 (CA). WU,
`Guohai
`[CA/CA]; 2103 Kendardine Road, Saskatoon,
`Saskatchewan S7N 3S5 (CA). CHENG,Bifang [CA/CA];
`Pbi, 110 Gymnasium Road, Saskatoon, Saskatchewan
`S7N OW9 (CA). TRUKSA, Martin [CA/CA]; 110 Gym-
`nasium Road, Saskatoon, Saskatchewan STN OW9 (CA).
`WETJEN, Tom [DE/DE]; Meerwiesenstrasse 21, 68163
`Mannheim (DE).
`
`(74) Anwalt: NEUEFEIND, Regina; Maiwald Patentanwalts
`GmbH,Elisenhof, Elisenstrasse 3, 80335 Miinchen (DE).
`
`(81) Bestimmungsstaaten (soweit nicht anders angegeben, fiir
`jede verfiigbare nationale Schutzrechtsart): AE, AG, AL,
`AM,AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BW,BY, BZ, CA, CH,
`CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EC, EE, EG, ES,
`FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU,ID,IL, IN,
`IS, JP, KE, KG, KM,KN,KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR,
`LS, LT, LU, LV, LY, MA, MD, MG, MK, MN, MW, Mx,
`MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM,PG,PH, PL, PT, RO,
`RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM,SV, SY, TJ, TM,
`TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM,ZW.
`
`(84) Bestimmungsstaaten (soweit nicht anders angegeben, fiir
`jede verfiigbare regionale Schutzrechtsart): ARIPO (BW,
`GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA,SD, SL, SZ, TZ, UG,
`ZM, ZW), eurasisches (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU,
`TJ, TM), europaisches (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK,
`EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU,IE,IS, IT, LT, LU, LV, MC,
`NL, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG,
`CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
`Ver6ffentlicht:
`mit internationalem Recherchenbericht
`vor Ablauf der fiir Anderungen der Anspriiche geltenden
`Frist; Veréffentlichung wird wiederholt, falls Anderungen
`eintreffen
`mit dem Sequenzprotokoliteil der Beschreibung in elektro-
`nischer Form getrennt verdffentlicht; auf Antrag vom In-
`ternationalen Biiro erhdltlich
`
`Zur Erkldrung der Zweibuchstaben-Codes und der anderen Ab-
`kiirzungen wird auf die Erkldrungen ("Guidance Notes on Co-
`des and Abbreviations") am Anfangjeder reguldren Ausgabe der
`PCT-Gazette verwiesen.
`
`NUTRTAAAA
`
`(54) Title: METHOD FOR PRODUCING POLYUNSATURATEDFATTY ACIDS
`
`(54) Bezeichnung: VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON MEHRFACH UNGESATTIGTEN FETTSAUREN
`
`(57) Abstract: The invention relates to a method for producing eicosapentanoic acid, docosapentanoic acid and/or docohexanoic
`acid in transgenic plants. According to said method, the plant is provided with at least one nucleic acid sequence coding for a
`polypetide with a A6 desaturaseactivity, at least one nucleic acid sequence coding for a polypeptide with a A6 elongaseactivity, at
`least one nucleic acid sequence coding for a polypeptide with a A5 desaturaseactivity, and at least one nucleic acid sequence coding
`— for a polypeptide with a A5 elongaseactivity, the nucleic acid sequence coding for a polypeptide with a A5 elongaseactivity being
`modified in relation to the nucleic acid sequence in the organism from which the sequence originates, such that it is adapted to the
`rr codon use in at least one type of plant. For the production of docosahexanoic acid, at least one nucleic acid sequence coding for a
`2 polypeptide with a A4 desaturase activity is also introduced into the plant.
`GN (57) Zusammenfassung: Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaensdure, Docosapenta-
`© ensiure und/oder Docosahexaensdure in transgenen Pflanzen, indem in der Pflanzebereitgestellt werden mindestens eine Nukleinsau-
`~~ Tesequenz, welchefiir ein Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitat kodiert,; mindestens eine Nukleinséuresequenz, welche fiir
`&> ein Polypeptid mit einer A6-Elongase-Aktivitat kodiert; mindestens eine Nukleinséuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer
`© Ad5-Desaturase-Aktivitat kodiert; und mindestens eine Nukleinsiuresequenz, welchefiir ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Ak-
`tivitét kodiert, wobei die Nukleinséuresequenz, welchefiir ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert, gegeniiber der
`Nukleinsauresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verindertist, dass sie an die Kodonverwendung
`in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasstist. Fiir die Herstellung von Docosahexaensdure wird zusatzlich eine oder mehrere
`Nukleinsauresequenzen,die fiir ein Polypeptid mit einer A4-Desaturase-Aktivitat kodiert, in die Pflanze eingebracht.
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
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`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesattigten Fettsauren
`
`Die vorliegende Erfindungbetrifft ein Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaensaure,
`
`Docosapentaensdure und/oder Docosahexaensaure in transgenen Pflanzen, indem in der
`
`Pflanze bereitgestellt werden mindestens eine Nukleinsaéuresequenz, welchefiir ein
`
`Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitat kodiert; mindestens eine Nukleinsauresequenz,
`
`welchefiir ein Polypeptid mit einer A6-Elongase-Aktivitaét kodiert; mindestens eine
`
`10
`
`Nukleinséuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A5-Desaturase-Aktivitat kodiert;
`
`und mindestens eine Nukleinsauresequenz, welche fir ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-
`
`Aktivitat kodiert,
`
`wobei die Nukleinsauresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat
`
`kodiert, gegentiber der Nukleinséuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz
`
`15
`
`stammt, dadurch verandert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren
`
`Pflanzenarten angepasstist.
`
`In einer bevorzugten Ausfiihrungsform werden zusatzlich weitere Nukleinsauresequenzen, die
`
`fiir ein Polypeptid mit der Aktivitaét einer @3-Desaturase und/oder einer A4-Desaturase
`
`20
`
`kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`In einer weiteren bevorzugten Ausfthrungsform werden weitere Nukleinsauresequenzen, die
`
`fiir Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)—Desaturase(n), Acyl—
`
`ACP-Thioesterase(n), Fettsfure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-
`
`25
`
`Acyltransferase(n), Fettsaure-Synthase(n), Fettsaure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-
`
`Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A—Oxidase(n), Fettsaure—Desaturase(n), Fettsaure—
`
`Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol—Lipasen, Allenoxid—Synthasen,
`
`Hydroperoxid—Lyasen oder Fettsaure—Elongase(n) kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
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`WO2007/096387
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`PCT/EP2007/051675
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`Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Nukleinséuremolektile, umfassend mindestens
`
`eine Nukleinsauresequenz,die ftir ein Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitat kodiert;
`
`mindestens eine Nukleinséuresequenz, die fiir ein Polypeptid mit einer A5-Desaturase-
`
`Aktivitat kodiert; mindestens eine Nukleinséuresequenz,die ftir ein Polypeptid mit einer A6-
`
`Elongase-Aktivitat kodiert; und mindestens eine Nukleinsauresequenz, die fiir ein Polypeptid
`
`mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert und die gegentiber der Nukleinsauresequenz in dem
`
`Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verdndert ist, dass sie an die
`
`Kodonverwendungin einer oder mehreren Pflanzenarten angepasstist.
`
`10
`
`Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Ole, Lipide und/oder Fettsduren, die nach dem
`
`erfindungsgemafien Verfahren hergestellt wurden, und deren Verwendung.
`
`SchlieBlich betrifft die Erfindung auch transgene Pflanzen, die nach dem erfindungsgemafen
`
`15
`
`Verfahren hergestellt wurden oder die ein erfindungsgemafes rekombinantes Nukleinsaure-
`
`molekul enthalten, und deren Verwendung als Nahrungs- oder Futtermittel.
`
`Die Lipidsynthese lasst sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsauren und
`
`ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer polaren
`Kopfgruppe. Ubliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide,
`
`20
`
`Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettséuresynthese beginnt mit der
`
`Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase oder in
`
`Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese
`
`beiden Produktmolektile zusammen Acetoacetyl-ACP, das tiber eine Reihe von Konden-
`
`25
`
`sations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so dass ein
`
`gesattigtes Fettsauremolekiil mit der gewiinschten Kettenlange erhalten wird. Die Produktion
`
`der ungesattigten Fettsfuren aus diesen Molekiilen wird durch spezifische Desaturasen
`
`katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (beziiglich
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`der Fettséuresynthese in Mikroorganismensiehe F.C. Neidhardtet al. (1996) E. coli und
`
`Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., S. 612-636 und darin enthaltene Literaturstellen;
`
`Lengeler et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die
`
`enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson,K., et al. (1993) Microbiological Reviews
`
`57:522-542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide
`
`gebundenenFettsauren miissen anschlieBend fiir die weiteren Elongationen aus den
`
`Phospholipiden wiederin den FettsaureCoA-Ester-Pool tiberftihrt werden. Dies erméglichen
`
`Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen. Weiterhin kénnen diese Enzymedie
`
`elongierten Fettsiuren wieder von den CoA-Estern auf die Phospholipide tibertragen. Diese
`
`10
`
`Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.
`
`Ferner missen Fettséuren anschliefiend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und
`
`in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der
`
`Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsauren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise
`
`15
`
`durch Glycerin-Fettsaure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166).
`
`Eine Ubersichttiber die Pflanzen-Fettsdurebiosynthese, Desaturierung, den Lipidstoffwechsel
`
`und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation,
`
`Fettsauremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und —Assemblierung
`
`20
`
`geben einschlieBlich der Literaturstellen die folgenden Artikel: Kinney (1997) Genetic
`
`Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge und Browse (1995) Plant Cell 7:957-
`
`970; Shanklin und Cahoon (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641;
`
`Voelker (1996) Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt (1992) Prog.
`
`Lipid R. 31:397-417; Giihnemann-Schafer & Kind! (1995) Biochim. Biophys Acta 1256:181-
`
`25
`
`186; Kunauet al. (1995) Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymneet al. (1993) in: Biochemistry
`
`and Molecular Biology of Membraneand Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und
`
`Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158; Murphy & Ross
`
`(1998) Plant Journal. 13(1):1-16.
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

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`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`Die mehrfach ungesattigten Fettsauren kénnen entsprechend ihrem Desaturierungsmuster in
`
`zwei grobe Klassen, die w-6- und die w-3-Fettsduren, eingeteilt werden, die metabolisch und
`
`funktionell unterschiedliche Aktivitéaten haben.
`
`Im Folgenden werden mehrfach ungesattigte Fettsauren als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder
`
`LCPUFAsbezeichnet(poly unsaturated fatty acids, PUFA, mehrfach ungesattigte Fettsauren;
`
`long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA,langkettige mehrfach ungesattigte
`
`Fettsauren).
`
`Als Ausgangsstofffiir den -6-Stoffwechselweg fungiert die Fettstiure Linolsiure (18:2°7"),
`wahrend der w-3-Wegiiber Linolensiure (18:3°7'*"°) ablauft. Linolensaure wird dabei durch
`
`die Aktivitat einer w-3-Desaturase aus Linolsdure gebildet (Tocheret al. (1998) Prog. Lipid
`
`Res. 37: 73-117 ; Domergueet al. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 4105-4113).
`
`Saugetiere und damit auch der Mensch verftigen tiber keine entsprechende Desaturaseaktivitat
`
`(A-12- und -3-Desaturase) zur Bildung dieser Ausgangsstoffe und miissen daher diese
`Fettsduren (essentielle Fettsauren) iiber die Nahrung aufnehmen. Ubereine Abfolge von
`
`Desaturase- und Elongase-Reaktionen werden dann aus diesen Vorstufen die physiologisch
`wichtigen mehrfach ungesittigten Fettsauren Arachidonsidure (= ARA, 20:4°°°!14), eine -
`6-Fettsdure und die beiden w-3-Fettsauren Eicosapentaen- (= EPA, 20:5°°°!!'*!7) und
`Docosahexaensaure (DHA, 22:6°07'°8:!7) synthetisiert.
`
`10
`
`15
`
`20
`
`Die Verlaéngerung von Fettsaéuren durch Elongasen um 2 bzw. 4 C-Atomeist fiir die
`
`25
`
`Produktion von Cy9- bzw. C2.-PUFAsvon entscheidender Bedeutung. Dieser Prozess verlauft
`
`uber 4 Stufen. Den ersten Schritt stellt die Kondensation von Malonyl-CoA an das Fettsaure-
`
`Acyl-CoA durch die Ketoacyl-CoA-Synthase (KCS, im weiteren Text als Elongase
`
`bezeichnet) dar. Es folgt dann ein Reduktionsschritt (Ketoacyl-CoA-Reduktase, KCR), ein
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
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`PCT/EP2007/051675
`
`Dehydratationsschritt (Dehydratase) und ein abschliefiender Reduktionsschritt (Enoyl-CoA-
`
`Reduktase). Es wurde postuliert, dass die Aktivitaét der Elongase die Spezifitat und
`
`Geschwindigkeit des gesamten Prozesses beeinflusst (Millar and Kunst (1997) Plant Journal
`
`12:121-131).
`
`Fur Fettsauren und Triacylglyceride besteht eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebens-
`
`mittelindustrie, der Tierernahrung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem, ob es
`
`sich um freie gesattigte und ungesattigte Fettsauren oder um Triacylglyceride mit einem
`
`erhdhten Gehalt an gesattigten oder ungesattigten Fettsauren handelt, sind sie fiir die
`
`10
`
`unterschiedlichsten Anwendungen geeignet. So werden z.B. in der humanen Eméhrung
`
`Lipide mit ungesattigten, speziell mehrfach ungesattigten, Fettsduren bevorzugt. Den
`
`mehrfach ungesattigten w-3-Fettsauren wird dabei ein positiver Effekt auf den
`
`Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Prévention einer Herzerkrankung zuge-
`
`schrieben. Durch Zugabedieser w-3-Fettsauren zur Nahrung kann das Risiko einer
`
`15
`
`Herzerkrankung, eines Schlaganfalls oder von Bluthochdruck deutlich verringert werden
`
`(Shimikawa (2001) World Rev. Nutr. Diet. 88: 100-108).
`
`Auchentziindliche, speziell chronisch entziindliche, Prozesse im Rahmen immunologischer
`
`Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis lassen sich durch w-3-Fettsauren positiv
`
`20
`
`beeinflussen (Calder (2002) Proc. Nutr. Soc. 61: 345-358; Cleland und James (2000)
`
`J. Rheumatol. 27: 2305-2307). Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell diatetischen
`
`Lebensmitteln, zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung. -6-Fettséuren wie
`
`Arachidonsaure tiben bei diesen rheumatischen Erkrankungen eher einen negativen Effekt
`
`aus.
`
`25
`
`@-3- und -6-Fettsduren sind Vorlaéufer von Gewebshormonen,den sogenannten
`
`Eicosanoiden wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo-y-linolensaure,
`
`der Arachidonsdure und der Eicosapentaensaure ableiten, und den Thromboxanen und
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`Leukotrienen, die sich von der Arachidonsaure und der Eicosapentaensaure ableiten.
`
`Eicosanoide (sog. PG»-Serie), die aus @-6-Fettsauren gebildet werden, fordern in der Regel
`
`Entziindungsreaktionen, wahrend Eicosanoide (sog. PG3-Serie) aus w-3-Fettsduren geringe
`
`oder keine entziindungsf6rdernde Wirkung haben.
`
`Mehrfach ungesattigte langkettige m-3-Fettséuren wie Eicosapentaensdure (= EPA,
`€20:5°°*!1!4:17) oder Docosahexaensiure (= DHA, C22:6°47!93:!!°) sind wichtige
`
`Komponenten der menschlichen Ernahrung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in der
`
`Gesundheit, die Aspekte wie die Entwicklung des kindlichen Gehirns, die Funktionalitat des
`
`10
`
`Auges, die Synthese von Hormonen undandererSignalstoffe, sowie die Vorbeugung von
`
`Herz-Kreislauf-Beschwerden, Krebs und Diabetes umfassen (Poulos, A (1995) Lipids 30:1-
`
`14; Horrocks, LA und Yeo YK (1999) Pharmacol Res 40:211-225).
`
`Aufgrundder heute tiblichen Zusammensetzung der menschlichen Nahrungist ein Zusatz von
`
`15
`
`mehrfach ungesattigten w-3-Fettsauren, die bevorzugt in Fischédlen vorkommen, zur Nahrung
`
`besonders wichtig. So werden beispielsweise mehrfach ungesattigte Fettsauren wie Docosa-
`hexaensiure (= DHA, C22:6°*7"'°!9-!®!9) oder Eisosapentaensaure (= EPA, C20:5°°%!11417)
`
`der Babynahrung zur Erhdhung des Nahrwertes zugesetzt. Es besteht aus diesem Grund ein
`
`Bedarf an der Produktion mehrfach ungesattigter langkettiger Fettsauren.
`
`20
`
`Hauptsachlich werden die verschiedenen Fettséuren und Triglyceride aus Mikroorganismen
`wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Ol-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps
`
`und Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum und weiteren gewonnen, wobeisie in
`
`der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Triglycerole) anfallen. Sie konnen
`
`25
`
`aber auch aus Tieren wie z.B. Fischen gewonnen werden.Die freien Fettsauren werden
`
`vorteilhaft durch Verseifung der Triacylglyceride hergestellt. Sehr langkettige mehrfach
`ungesattigte Fettsauren wie DHA, EPA, Arachidonsdure (ARA, C20:4°81b4), Dihomo-y-
`linolensdure (DHGL, C20:3“*'"!*) oder Docosapentaensiure (DPA, C22:547!%13!®!°) werden
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`in Olfruchtpflanzen wie Raps, Soja, Sonnenblume, Farbersaflor jedoch nicht synthetisiert.
`Ubliche natiirliche Quellen fiir diese Fettsduren sind Fische wie Hering, Lachs, Sardine,
`
`Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch oder Algen.
`
`Aufgrund der positiven Eigenschaften der mehrfach ungesattigten Fettséuren hat es in der
`
`Vergangenheit nicht an Ansatzen gefehlt, Gene, die an der Synthese dieser Fettsduren bzw.
`Triglyceride beteiligt sind, fiir die Herstellung von Olen in verschiedenen Organismen
`
`mit geandertem Gehalt an ungesattigten Fettséuren verfiigbar zu machen. So wird in
`WO91/13972 und seinem US—Aquivalent eine A-9—Desaturase beschrieben.In
`
`10
`
`WO 93/11245 wird eine A-15—Desaturase und in WO 94/11516 eine A-12—Desaturase
`
`beansprucht. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP—A—0 550 162, WO 94/18337,
`
`WO97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP—A-0 794 250, Stukeyet al. (1990) J. Biol.
`
`Chem., 265: 20144-20149, Wadaet al. (1990) Nature 347: 200-203 oder Huangetal. (1999)
`
`Lipids 34: 649-659 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen
`
`15
`
`Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membran-
`
`gebundene Proteine nur sehr schwerzu isolieren und zu charakterisieren sind (McKeonetal.
`
`(1981) Methods in Enzymol. 71: 12141-12147, Wanget al. (1988) Plant Physiol. Biochem.,
`
`26: 777-792).
`
`20
`
`In der Regel erfolgt die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen durch Ein-
`
`bringung in einen geeigneten Organismus, der anschliefiend auf Enzymaktivitat mittels
`
`Edukt- und Produktanalyse untersucht wird. A-6—Desaturasen werden in WO 93/06712,
`
`US 5,614,393, WO 96/21022, WO 00/21557 und WO 99/27111 beschrieben. Die Anwendung
`
`dieses Enzyms zur Produktion von Fettsauren in transgenen Organismen wird in
`
`25
`
`WO98/46763, WO 98/46764 und WO 98/46765 beschrieben. Die Expression verschiedener
`
`Desaturasen und die Bildung mehrfach ungesattigter Fettsduren wird auch in WO 99/64616
`
`oder WO 98/46776 beschrieben und beansprucht. Bzgl. der Effektivitat der Expression von
`
`Desaturasen und ihrem Einfluss auf die Bildung mehrfach ungesattigter Fettsaurenist
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`anzumerken, dass durch Expression einer einzelnen Desaturase wie bisher beschrieben
`
`lediglich geringe Gehalte an ungesattigten Fettsduren/Lipiden wie z.B. y-Linolensaure und
`
`Stearidonsdure erreicht wurden.
`
`In der Vergangenheit wurden zahlreiche Versuche unternommen, Elongase-Gene zu erhalten.
`
`Millar and Kunst (1997) Plant Journal 12:121-131 und Millar et al. (1999) Plant Cell 11:825-
`
`838 beschreiben die Charakterisierung von pflanzlichen Elongasen zur Synthese von einfach
`
`ungesattigten langkettigen Fettsauren (C22:1) bzw. zur Synthese von sehr langkettigen
`
`Fettsauren fiir die Wachsbildung in Pflanzen (C2s-C32). Beschreibungen zur Synthese von
`
`10
`
`Arachidonsaure und EPAfinden sich beispielsweise in WO 01/59128, WO 00/12720,
`
`WO02/077213 und WO 02/08401. Die Synthese von mehrfach ungesattigter C24-Fettsaéuren
`
`ist beispielsweise in Tvrdik et al. (2000) J. Cell Biol. 149: 707-718 oder in WO 02/44320
`
`beschrieben.
`
`15
`
`Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAssind Mikroalgen wie
`
`Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-Arten, Thraustochytrien-Arten, Schizochytrien-
`
`Arten oder Crypthecodinium-Arten, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium,Pilze, wie
`
`Mortierella, Entomophthora oder Mucor und/oder Moose wie Physcomitrella, Ceratodon und
`
`Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K.
`
`20
`
`Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and
`
`Biotechnology 73: 269-278). Durch Stammselektion ist ene Anzahl von Mutantenstammen
`
`der entsprechenden Mikroorganismen entwickelt worden, die eine Reihe wiinschenswerter
`
`Verbindungen,einschlieBlich PUFAs, produzieren. Die Mutation und Selektion von Stammen
`
`mit verbesserter Produktion eines bestimmten Molekitils wie den mehrfach ungesattigten
`
`25
`
`Fettsauren ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Mit Hilfe der vorge-
`
`nannten Mikroorganismen lassen sich zudem nur begrenzte Mengen der gewtinschten
`
`mehrfach ungesattigten Fettsduren wie DPA, EPA oder ARA herstellen, die noch dazu in der
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`Regel als Fettsauregemische anfallen. Deshalb werden, wann immer mdglich, gentechno-
`
`logische Verfahren bevorzugt.
`
`Hohere Pflanzen enthalten mehrfach ungesattigte Fettsauren wie Linolsaure (C18:2) und
`
`Linolensaure (C18:3). ARA, EPA und DHA kommen im Samen6l hoherer Pflanzen gar nicht
`
`oder nur in Spuren vor (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales. Technique &
`
`Documentation — Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Es ware jedoch vorteilhaft, in
`hdheren Pflanzen, bevorzugt in Olsaaten wie Raps, Lein, Sonnenblume und Soja, LCPUFAs
`
`herzustellen, da auf diese Weise groke Mengen qualitativ hochwertiger LCPUFAsfiir die
`
`10
`
`Lebensmittelindustrie, die Tierernahrung undfiir pharmazeutische Zwecke kostenginstig
`
`gewonnen werden kénnen. Hierzu werden vorteilhafterweise tiber gentechnische Methoden
`Gene,die fiir Enzyme der Biosynthese von LCPUFAskodieren, in Olsaaten eingefiihrt und
`
`exprimiert. Dies sind Gene, die beispielsweise fiir A-6-Desaturasen, A-6-Elongasen, A-5-
`
`Desaturasen oder A-4-Desaturasen kodieren. Diese Gene kénnen vorteilhaft aus Mikro-
`
`15
`
`organismen und niederen Pflanzen isoliert werden, die LCPUFAsherstellen und in den
`
`Membranenoder Triacylglyceriden einbauen. So konnten bereits A-6-Desaturase-Gene aus
`
`dem MoosPhyscomitrella patens und A-6-Elongase-Geneaus P. patens und dem Nematoden
`
`C. elegansisoliert werden.
`
`20
`
`Transgene Pflanzen,die ftir Enzyme der LCPUFA-Biosynthese kodierende Gene enthalten
`
`und exprimieren und als Folge dessen LCPUFAsproduzieren, wurden beispielsweise in
`
`DE-A-102 19 203 (Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesattigter Fettséuren in Pflanzen)
`
`beschrieben. Diese Pflanzen produzieren allerdings LCPUFAsin Mengen,die fiir eine
`Aufarbeitung der in den Pflanzen enthaltenen Ole noch weiter optimiert werden miissen. So
`
`25
`
`betragt der Gehalt von ARA in den in DE-A-102 19 203 beschriebenen Pflanzen lediglich 0,4
`
`bis 2% und der Gehalt von EPA lediglich 0,5 bis 1%, jeweils bezogen auf den Gesamt-
`
`lipidgehalt der Pflanze.
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`10
`
`Umeine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit mehrfach ungesattigten, langkettigen
`
`Fettsauren zu erméglichen, besteht daher ein grofer Bedarf an einem einfachen, kosten-
`
`giinstigen Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesattigten, langkettigen Fettsaéuren
`
`speziell in pflanzlichen Systemen.
`
`Eine Aufgabe der Erfindungist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem langkettige,
`
`mehrfach ungesattigte Fettsauren, insbesondere Eicosapentaensdure, Docosapentaensdure
`
`und/oder Docosahexaensidure, in transgenen Pflanzen in groBer Menge preiswert hergestellt
`
`werden kénnen.
`
`Es wurde nun tiberraschenderweise herausgefunden, dass durch die Expression einer
`
`optimierten A5-Elongase-Sequenz in transgenen Pflanzen die Ausbeute an langkettigen,
`
`mehrfach ungesattigten Fettsauren, insbesondere Eicosapentaensdure, Docosapentaensaure
`
`und/oder Docosahexaensaure, gesteigert werden kann.
`
`10
`
`15
`
`Die durch das erfindungsgemaBe Verfahren hergestellten PUFAs umfassen eine Gruppe von
`
`Molekiilen, die héhere Tiere nicht mehr synthetisieren k6nnen und somit aufnehmen miissen
`
`oder die hdhere Tiere nicht mehr ausreichendselbst herstellen k6nnen und somit zusatzlich
`
`aufnehmen miissen, obwohlsie leicht von anderen Organismen, wie Bakterien, synthetisiert
`
`20
`
`werden k6nnen.
`
`Entsprechend wird die Aufgabe der Erfindung gelést durch das erfindungsgemaBe Verfahren
`
`zur Herstellung von Eicosapentaensdure, Docosapentaensdure und/oder Docosahexaensaure
`
`in einer transgenen Pflanze, umfassend das Bereitstellen in der Pflanze von mindestens einer
`
`25
`
`Nukleinséuresequenz, welchefiir ein Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitat kodiert;
`
`mindestens einer Nukleinsaéuresequenz, welche fir ein Polypeptid mit einer A6-Elongase-
`
`Aktivitaét kodiert; mindestens einer Nukleinsauresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`11
`
`A5-Desaturase-Aktivitaét kodiert; und mindestens einer Nukleinsaéuresequenz, welche fiir ein
`
`Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert,
`
`wobei die Nukleinsauresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat
`
`kodiert, gegentiber der Nukleinséuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz
`
`stammt, dadurch verandert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren
`
`Pflanzenarten angepasstist. Fiir die Produktion von DHA muss desweiteren mindestenseine
`
`Nukleinsaéuresequenz, welchefiir ein Polypeptid mit einer A4-Desaturase-Aktivitat kodiert, in
`
`der Pflanze bereitgestellt werden.
`
`10
`
`Das "Bereitstellen in der Pflanze" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass
`
`Mafinahmen getroffen werden, so dass die Nukleinsauresequenzen kodierendfir ein
`
`Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitat, ein Polypeptid mit einer A6-Elongase-
`
`Aktivitat, ein Polypeptid mit einer A5-Desaturase-Aktivitat und ein Polypeptid mit einer A5-
`
`Elongase-Aktivitat zusammen in einer Pflanze vorliegen. Das "Bereitstellen in der Pflanze”
`
`15
`
`umfasst somit das Einbringen der Nukleinséuresequenzen in die Pflanze sowohl durch Trans-
`
`formation einer Pflanze mit einem oder mehreren rekombinanten Nukleinséuremolekiilen, die
`
`die genannten Nukleinsduresequenzen enthalten, als auch durch Verkreuzung von geeigneten
`
`Elternpflanzen, die eine oder mehrere der genannten Nukleinsauresequenzen enthalten.
`
`20
`
`Die Nukleinséuresequenz,die fiir ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert, ist
`
`erfindungsgema} gegeniiber der Nukleinsaéuresequenz in dem Organismus, aus dem die
`
`Sequenz stammt, dadurch verandert, dass sie an die Kodonverwendungin einer oder
`
`mehreren Pflanzenarten angepasstist. Dies bedeutet, dass die Nukleinséuresequenz gezielt fiir
`
`die Zwecke der Erfindung optimiert wurde, ohne dass dadurch die von der
`
`25
`
`Nukleinséuresequenz kodierte Aminosaéuresequenz verandert wurde.
`
`Der genetische Code ist redundant, da er 61 Kodons verwendet, um 20 Aminosauren zu
`
`spezifizieren. Daher werden die meisten der 20 proteinogenen Aminoséuren von mehreren
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`12
`
`Tripletts (Kodons) kodiert. Die synonymen Kodons, die eine einzelne Aminosaure spezi-
`
`fizieren, werden in einem bestimmten Organismusjedoch nicht mit gleicher Haufigkeit
`
`verwendet, sondern es gibt bevorzugte Kodons, die haufig verwendet werden und Kodons, die
`
`seltener verwendet werden. Diese Unterschiede in der Kodonverwendung werden zuriick-
`
`gefuhrt auf selektive evolutionare Driicke und vor allem die Effizienz der Translation. Ein
`
`Grundfir die geringere Translationseffizienz von selten auftretenden Kodons k6nnte darin
`
`liegen, dass die entsprechenden Aminoacyl-tRNA-Pools erschépft werden und damit nicht
`
`mehr zur Proteinsynthese zur Verftigung stehen.
`
`10
`
`AuBerdem bevorzugen unterschiedliche Organismen unterschiedliche Kodons. Daher lauft
`
`beispielsweise die Expression einer rekombinanten DNA,die aus einer Séugerzelle stammt,
`
`in E. coli-Zellen haufig nur suboptimal ab. Deshalb kann der Austausch selten verwendeter
`
`Kodons gegen haufig verwendete Kodons in manchen Fallen die Expression erhéhen. Ohne
`
`an eine Hypothese gebundensein zu wollen, wird angenommen,dass die kodonoptimierten
`
`15
`
`DNA-Sequenzeneine effizientere Translation erméglichen und die daraus gebildeten mRNAs
`
`méglicherweise eine hohere Halbwertszeit in der Zelle besitzen und daher haufigerftir die
`
`Translation zur Verfiigung stehen. Aus dem vorstehend gesagten folgt, dass eine
`
`Kodonoptimierung nur dann ndtig ist, wenn der Organismus, in dem die Nukleinsauresequenz
`
`exprimiert werden soll, ein andererist als der Organismus, aus dem die Nukleinsauresequenz
`
`20
`
`urspriinglich stammt.
`
`Fur viele Organismen, von denen die DNA-Sequenz einer gréReren Zahl von Genen bekannt
`
`ist, gibt es Tabellen, denen man die Haufigkeit der Verwendung bestimmter Kodons in dem
`
`jeweiligen Organismus entnehmen kann. Mit Hilfe dieser Tabellen lassen sich Protein-
`
`25
`
`sequenzen mit relativ grofer Genauigkeit in eine DNA-Sequenz zuriickiibersetzen, die die
`
`im jeweiligen Organismus bevorzugten Kodonsftir die verschiedenen Aminosauren des
`
`Proteins enthalt. Tabellen zur Kodonverwendung kénnenu.a. unter der folgenden Internet-
`
`Adresse aufgefunden werden:
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
`
`13
`
`http://www.kazusa.or.jp/Kodon/E.html. Dariiber hinaus bieten mehrere Firmen Software fiir
`
`die Genoptimierung an, wie z.B. die Firma Entelechon (Software Leto) oder die Firma
`
`Geneart (Software GeneOptimizer).
`
`Die Anpassung der Sequenzen an die Kodonverwendung in einem bestimmten Organismus
`
`kann unter Zuhilfenahmeverschiedener Kriterien erfolgen. Zum einen kannfiir eine
`
`bestimmte Aminosaure immerdas am héufigsten im ausgewahlten Organismus vorkommende
`
`Kodon verwendet werden, zum anderen kann aber auch die natiirliche Frequenz der ver-
`
`schiedenen Kodonsberiicksichtigt werden, so dass alle Kodonsfiir eine bestimmte
`
`10
`
`Aminosaure entsprechendihrer natiirlichen Haufigkeit in die optimierte Sequenz eingebaut
`
`werden. Dabei kann die Auswahl, an welcher Position welches Basen-Triplett verwendet
`
`wird, zufallig stattfinden. Erfindungsgemafi wurde die DNA-Sequenz unter Beriicksichtigung
`
`der natiirlichen Haufigkeit einzelner Kodons angepasst, wobei die Verwendung des am
`
`haufigsten im ausgewdhlten Organismus vorkommenden Kodonsebenfalls geeignetist.
`
`15
`
`Besonders bevorzugt ist eine Nukleinsauresequenz aus Ostreococcus tauri, die fiir
`
`ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert, wie beispielsweise das in SEQ ID No.
`
`110 dargestellte Polypeptid, zumindest an die Kodonverwendungin Raps, Soja und/oder Lein
`
`angepasst. Bei der urspriinglich aus Ostreococcus tauri stammenden Nukleins4uresequenz
`
`20
`
`handelt es sich bevorzugt um die in SEQ ID No. 109 )dargestellte Sequenz. Die fiir die A5-
`
`Elongase kodierende DNA-Sequenz ist an mindestens 20% der Positionen, bevorzugt an
`
`mindestens 30% der Positionen, besonders bevorzugt an mindestens 40% Positionen und am
`
`meisten bevorzugt an mindestens 50% der Positionen an die Kodonverwendung in Raps, Soja
`
`und/oder Lein angepasst.
`
`25
`
`Am meisten bevorzugt handelt es sich bei der verwendeten Nukleinséuresequenz um die in
`
`SEQ ID No. 64 angegebene Sequenz.
`
`CSIRO Exhibit 1003
`