Document made available under
`the
`Patent Cooperation Treaty (PCT)
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`International application number: PCT/EP2007/051675
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`International filing date:
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`21 February 2007 (21.02.2007)
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`Document type:
`
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`Certified copy of priority document
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`
`Country/Office: DE
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`Document details:
`Number: 10 2006 008 030.0
`Filing date: 21 February 2006 (21.02.2006)
`
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`Date of receipt at the International Bureau: 15 May 2007 (15.05.2007)
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`
`Remark: Priority document submitted or transmitted to the International Bureau in
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`
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`
`compliance with Rule 17 .1 ( a) or (b)
`
`World Intellectual Property Organization (WIPO) -Geneva, Switzerland
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`Organisation Mondiale de la Propriete Intellectuelle (OMPI) -Geneve, Suisse
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`CSIRO Exhibit 1004
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`BUNDESREPUBLIK . DEUTSCHLAND
`E'<O t/ s 1 b1 'J
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`---========---:..___;_.
`
`Prioritätsbescheinigung
`DE 10 2006 008 030.0
`über die Einreichung einer Patentanmeldung
`
`•
`
`1
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`Aktenzeichen:
`
`10 2006 008 030.0
`
`Anmeldetag:
`
`21. Februar .Q006
`.
`
`Anmelder/Inhaber:
`
`BASF Plant Science GmbH, 67056 Ludwigshafen/DE
`
`Bezeichnung:
`
`Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättig­
`
`
`ten F�ttsäuren
`
`'IPC:
`
`C 12 N 15/29
`
`·Die· angehefteten Stücke sind ei�e richtige und genaue Wiedergabe der ur­
`
`
`sprünglichen Unterlagen dieser Patentanmeldung.' '
`
`München, den 21. September 2006
`Deutsches Patent-und Markenamt·
`Der Präsident
`Im Auftrag
`
`2.
`
`Kah\e
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`CSIRO Exhibit 1004
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`A9161
`03/00
`EDV-L
`
`

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`� '
`�· B MAIWALD PATENTANWALTS GMBH
`
`Aktenzeichen
`Neuanmeldung
`
`Unser Zeichen
`B 8012 /RN
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` �· ·.„ . .. .. „��.�,„·_�i.: „ :._.
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`
`
`München · Hamburg · Düsseldorf
`New York
`·
`Patentanwalte
`Dr. Walter Maiwald (München)
`Dr. Volker Hamm (Hamburg)
`
`Dr. Stefan Michalskl (Düsseldorf)
`Dr. Reglna Neuefelnd LL.M. (München)
`
`
`Dipl.-Ing. Korblnlan Kopf, M.A. (München)
`
`Dipl.-Ing. Luii Kieizmann ll.M. (Düsseldorf)
`Dr. Norbert Hansen (München)
`Dr. Martin Huenges (München)
`Dr. Holger Glas LL..M. (München)
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`Dr. Sigrid von Kroslgk (Hamburg)
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`Dipl.-Ing. Ulrich Magerlein (München)
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`Dr. Eva Ehlich (München)
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`Dr. $enay Has-Becker .<Hamburg)
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`Dr. Son)a Althausen (Düsseldorf)
`Dr. Aloys Hüttermann (Düsseldorf)
`Dr. Rüdiger Haeusler (München) .
`
`Dipl.-Ing. Connna Wiedmann (Düsseldorf)
`Dr. Alexander Wittkop p (Hamburg)
`
`Rechtsanwalte
`
`Stephan N. Schneller (München)
`
`Matthias Gottschalk, MBA (München)
`München,
`2 1 . Februar 2006
`
`BASF Plant Science GmbH
`BPS - A30, 67056 Ludwigshafen, Deutschland
`
`Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren
`--------------------------�-------------------------------------------------------------------------------
`
`Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaensffiire:· ·­
`Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure in transgenen Pflanzen, indem in der
`Pflanze bereitgestellt werden mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein
`Polypeptid mit einer �6-Desaturase-Aktivität kodiert; mindestens eine Nukleinsäuresequenz,
`welche für ein Polypeptid mit einer �6-Elongase-Aktivität kodiert; mindestens eine
`Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer �5-Desaturase-Aktivität kodiert;
`und mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer �5-Elongase­
`Aktivität kodiert,
`
`Kontakt:
`
`
`Geschäftsführer:
`
`RN:LA:uh
`Postfach 330523 · 80065 München· Elisenhof · Elisenstrasse
`3 · 80335 München· Tel. +49 (0)89 74 72 660 ·Fax +49 (0)89 77 64 24
`Dr. W. Maiwald · Dr. V. Hamm . Dr. S. Mlchalski
`K. Kopf · Dr. N. Hansen · Dr. H. Glas ·
`http://www.maiwald.de · lnfo@maiwald.de
`L. Kietzmann
`· Dipl.-Ing.
`· Dr. R. Neuefeind · Dipl.-Ing.
`Dr. M. Huenges · HRB Nr. 111307
`n & Kozianka Rechtsanwälte
`(Hamburg)
`Kooperation mit: Dr. Schmldt-Felzman
`
`
`Parr · Tauche · Leutheusser-Schnarrenberger Rechtsanwälte (München · Starnberg)
`Maiwald lnc„ European IP Services. New York, Dipl.-Ing. Korbinian Kopf, MA. Dr. Alexander Wittkopp,
`U.S. Patent Agents
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`wobei die Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer ß5-Elongase-Aktivität
`kodiert, gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz
`stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren
`Pflanzenarten angepasst ist.
`
`In einer bevorzugten Ausführungsform werden zusätzlich weitere Nukleinsäuresequenzen, die
`für ein Polypeptid mit der Aktivität einer ro3-Desaturase und/oder einer ß4-Desaturase
`.kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden weitere Nukleinsäuresequenzen, die
`für Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)-Desaturase(n), Acyl­
`ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid­
`Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A­
`Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure­
`Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen,
`Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Nukleinsäuremoleküle, umfassend mindestens
`neine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer ß6-Desaturase-Aktivität kodiert;
`mindestens eine Nukleinsäureseq-uenz, die für ein Polypeptid mit einer ß5-Desaturase­
`Aktivität kodiert; mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid.mit einer ß6-
`Elongase-Aktivität kodiert; und mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid
`mit einer ß5-Elongase-Aktivität kodiert und die gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem
`Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die
`Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist.
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`Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Öle, Lipide und/oder Fettsäuren, die nach dem
`erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, und deren Verwendung.
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`Schließlich betrifft die Erfindung auch transgene Pflanzen, die nach dem erfindungsgemäßen
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`Verfahren hergestellt wurden oder die ein erfindungsgemäßes rekombinantes Nukleinsäure­
`
`molekül enthalten, und deren Verwendung als Nahrungs- oder Futtermittel.
`
`Die Lipidsynthese lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsäuren und
`ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer polaren
`Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide,
`Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der
`Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase oder in
`
`Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese
`beiden Produktmoleküle zusammen Acetoacetyl-ACP, das über eine Reihe von Konden­
`sations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so dass ein
`
`gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion
`der ungesättigten Fettsäuren aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen
`katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (bezüglich
`
`der Fettsäuresynthese in Mikroorganismen siehe F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und
`Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., S. 612-636 und darin enthaltene Literaturstellen;
`
`'Lengeler et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die
`enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews
`57:522-542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide
`gebundenen Fettsäuren müssen anschließend für die weiteren Elongationen aus den
`
`Phospholipiden wieder in den FettsäureCoA-Ester-Pool überführt werden. Dies ermöglichen
`
`Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen. Weiterhin können diese Enzyme die
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`elongierten Fettsäuren wieder von den CoA-Estem auf die Phospholipide übertragen. Diese
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`Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.
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`Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und
`in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der
`Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise
`
`durch Glycerin-Fettsäure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166).
`
`Eine Übersicht über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desa'turierung, den Lipidstoffwechsel
`und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation,
`Fettsäuremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und-Assemblierung
`geben einschließlich der Literaturstellen die folgenden Artikel: Kinney (1997) Genetic
`Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge und Browse (1995) Plant Cell 7:957-
`·
`Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641;
`970; Shanklin und Cahoon (1998) Annu.
`Voelker (1996) Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt (1992) Prog.
`Lipid R. 31:397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl (1995) Biochim. Biophys Acta 1256:181-
`186; Kunau et al. (1995) Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al. (1993) in: Biochemistry
`and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und
`Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158; Murphy & Ross
`(1998) Plant Journal. 13(1):1-16 .
`
`. Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren können entsprechend ihrem Desaturierungsmuster in
`
`zwei große Klassen, die ro-6- und die ro-3-Fettsäuren, eingeteilt werden, die metabolisch und
`
`funktionell unterschiedliche Aktivitäten haben.
`
`Irri Folgenden werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren als PUF A, PUF As, LCPUF A oder
`LCPUF As bezeichnet (12oly ynsaturated fatty �cids, PUF A, mehrfach ungesättigte Fettsäuren;
`long _g_hain 12.oly ynsaturated fatty �cids, LCPUF A, langkettige mehrfach ungesättigte
`Fettsäuren).
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`Als Ausgangsstoff für den co-6-Stoffwechselweg fungiert die Fettsäure Linolsäure (18:2Ä9·12
`),
`während der co-3-Weg über Linolensäure (18:3Ä9•12
`•15) abläuft. Linolensäure wird dabei durch
`die Aktivität einer co-3-Desaturase aus Linolsäure gebildet (Tocher et al. (1998) Prog. Lipid
`
`Res. 37: 73-117 ; Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 4105-4113).
`
`Säugetiere und damit auch der Mensch verfügen über keine entsprechende Desaturaseaktivität
`(�;..12- und co-3-Desaturase) zur Bildung dieser Ausgangsstoffe und müssen daher diese
`Fettsäuren (essentielle Fettsäuren) über die Nahrung aufnehmen. Über eine Abfolge von
`Desaturase- und Elongase-Reaktionen werden dann aus diesen Vorstufen die physiologisch
`wichtigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren Arachidonsäure (=ARA, 20:4Ä5·8•11•14), eine co-
`6-Fettsäure und die beiden co-3-Fettsäuren Eicosapentaen- (= EPA, 20:5Ä5•8•11•14·17) und
`Docosahexaensäure (DHA, 22:6M·7·10·13·17·19) synthetisiert.
`
`Die Verlängerung von Fettsäuren durch Elongasen um 2 bzw. 4 C-Atome ist für die
`Produktion von C20- bzw. C22-PUF As von entscheidender Bedeutung. Dieser Prozess verläuft
`über 4 Stufen. Den ersten Schritt stellt die Kondensation von Malonyl-CoA an das Fettsäure­
`Acyl-CoA durch die Ketoacyl-CoA-Synthase (KCS, im weiteren Text als Elongase
`bezeichnet) dar. Es folgt dann ein Reduktionsschritt (Ketoacyl-CoA-Reduktase, KCR), ein
`Dehydratationsschritt (Dehydratase) und ein abschließender Reduktionsschritt (Enoyl-CoA­
`
`Reduktase ). Es wurde postuliert, dass die Aktivität der Elongase die Spezifität und
`
`Geschwindigkeit des gesamten Prozesses beeinflusst (Millar and Kunst (1997) Plant Journal
`12:121-131).
`
`Für Fettsäuren und Triacylglyceride besteht eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebens­
`
`mittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem, ob es
`
`sich um freie gesättigte und ungesättigte Fettsäuren oder um Triacylglyceride mit einem
`
`erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die
`unterschiedlichsten Anwendungen geeignet. So werden z.B. in der humanen Ernährung
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`Lipide mit ungesättigten, speziell mehrfach ungesättigten, Fettsäuren bevorzugt. Den
`mehrfach ungesättigten ro-3-Fettsäuren wird dabei ein positiver Effekt auf den
`Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Prävention einer Herzerkrankung zuge­
`schrieben. Durch Zugabe dieser ro-3-Fettsäuren zur Nahrung kann das Risiko einer
`Herzerkrankung, eines Schlaganfalls oder von Bluthochdruck deutlich verringert werden
`(Shimikawa (2001) World Rev. Nutr. Diet. 88: 100-108).
`
`Auch entzündliche, speziell chronisch entzündliche, Prozesse im Rahmen immunologischer
`
`Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis lassen sich durch ro-3-Fettsäuren positiv
`
`beeinflussen (Calder (2002) Proc. Nutr. Soc. 61: 345-358; Cleland und James (2000)
`J. Rheumatol. 27: 2305-2307). Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell diätetischen
`Lebensmitteln, zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung. ro-6-Fettsäuren wie
`Arachidonsäure üben bei diesen rheumatischen Erkrankungen eher einen negativen Effekt
`
`aus.
`
`ro-3- und ro-6-Fettsäuren sind Vorläufer von Gewebshormonen, den sogenannten
`
`Eicosanoiden wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo-y-linolensäure,
`der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten, und den Thromboxanen und
`Leukotrienen, die sich von der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten.
`
`Eicosanoide (sog. PG2-Serie), die aus ro-6-Fettsäuren gebildet werden, fördern in der Regel
`Entzündungsreaktionen, während Eicosanoide (sog. PG3-Serie) aus ro-3-Fettsäuren geringe
`oder keine entzündungsfördernde Wirkung haben.
`
`Mehrfach ungesättigte langkettige ro-3-Fettsäuren wie Eicosapentaensäure (= EPA,
`C20:5Lis,s,II,I4,I7) oder Docosahexaensäure (= DHA, C22:6M,?,IO,I3,I6•19) sind wichtige
`Komponenten der menschlichen Ernährung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in der
`Gesundheit, die Aspekte wie die Entwicklung des kindlichen Gehirns, die Funktionalität des
`Auges, die Synthese von Hormonen und anderer Signalstoffe, sowie die Vorbeugung von
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`Herz-Kreislauf-Beschwerden, Krebs und Diabetes umfassen (Poulos, A (1995) Lipids 30:1-
`14; Horrocks, LA und Yeo YK (1999) Pharmacol Res 40:211-225).
`
`Aufgrund der heute üblichen Zusammensetzung der menschlichen Nahrung ist ein Zusatz von
`
`mehrfach ungesättigten co-3-Fettsäuren, die bevorzugt in Fischölen vorkommen, zur Nahrung
`besonders wichtig. So werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Docosa­
`hexaensäure (= DHA, C22:6M,?,l0,l3,l6,19) oder Eisosapentaensäure (= EPA, C20:5Li5,S,ll,l4,i7)
`der Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Es besteht aus diesem Grund ein
`Bedarf an der Produktion mehrfach ungesättigter langkettiger Fettsäuren.
`
`Hauptsächlich werden die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganisme�
`wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps
`und Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum und weiteren gewonnen, wobei sie in
`der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Triglycerole) anfallen. Sie können
`aber auch aus Tieren wie z.B. Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden
`vorteilhaft durch Verseifung der Triacylglyceride hergestellt. Sehr langkettige mehrfach
`ungesättigte Fettsäuren wie DHA, EPA, Arachidonsäure (ARA, C20:4Li5,S,ll,I4), Dihomo-y­
`linolensäure (DHGL, C20:3'M,ll,I4) oder Docosapentaensäure (DPA, C22:5ß?,I0,!3,J6,19) werden
`in Ölfruchtpflanzen wie Raps, Soja, Sonnenblume, Färbersaflor jedoch nicht synthetisiert.
`Übliche natürliche Quellen für diese Fettsäuren sind Fische wie Hering, Lachs, Sardine,
`Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch oder Algen.
`
`Aufgrund der positiven Eigenschaften der mehrfach ungesättigten Fettsäuren hat es in der
`Vergangenheit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese dieser Fettsäuren bzw.
`Triglyceride beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Organismen
`mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in
`WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine ß-9-Desaturase beschrieben. In
`WO 93/11245 wird eine Li-15-Desaturase und in WO 94/11516 eine Li-12-Desaturase
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`beansprucht. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337,
`WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al. (1990) J. Biol.
`Chem., 265: 20144-20149, Wada et al. (1990) Nature 347: 200-203 oder Huang et al. (1999)
`
`Lipids 34: 649-659 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen
`Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membran­
`
`gebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und zu charakterisieren sind (McKeon et al.
`(1981) Methods in Enzymol. 71: 12141-12147, Wang et al. (1988) Plant Physiol. Biochem.,
`
`26: 777-792).
`
`In der Regel erfolgt die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen durch Ein­
`
`bringung in einen geeigneten Organismus, der anschließend auf Enzymaktivität mittels
`Edukt- und Produktanalyse untersucht wird. 11-6-Desaturasen werden in WO 93/06712,
`US 5,61'4,393, WO 96/21022, WO 00/21557 und WO 99/27111 beschrieben. Die Anwendung
`dieses Enzyms zur Produktion von Fettsäuren in transgenen Organismen wird in
`WO 98/46763, WO 98/46764 und WO 98/46765 beschrieben. Die Expression verschiedener
`Desaturasen und die Bildung mehrfach ungesättigter Fettsäuren wird auch in WO 99/64616
`oder WO 98/46776 beschrieben und beansprucht. Bzgl. der Effektivität der Expression von
`Desaturasen und ihrem Einfluss auf die Bildung mehrfach ungesättigter Fettsäuren ist
`anzumerken, dass durch Expression einer einzelnen Desaturase wie bisher beschrieben
`
`lediglich geringe Gehalte an ungesättigten Fettsäuren/Lipiden wie z.B. r-Linolensäure und
`
`Stearidonsäure erreicht wurden.
`
`In der Vergangenheit wurden zahlreiche Versuche unternommen, Elongase-Gene zu erhalten.
`Millar and Kunst (1997) Plant Joumal 12:121-131 und Millar et al. (1999) Plant Cell 11 :825-
`
`838 beschreiben die Charakterisierung von pflanzlichen Elongasen zur Synthese von einfach
`ungesättigten langkettigen Fettsäuren (C22:1) bzw. zur Synthese von sehr langkettigen
`Fettsäuren für die Wachsbildung in Pflanzen (C2s-C32). Beschreibungen zur Synthese von
`Arachidonsäure und EP A finden sich beispielsweise in WO 01/59128, WO 00/12720,
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`WO 02/077213 und WO 02/08401. Die Synthese von mehrfach ungesättigter C24-Fettsäuren
`ist beispielsweise in Tvrdik et al. (2000) J. Cell Biol. 149: 707-718 oder in WO 02/44320
`beschrieben.
`
`Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUF As sind Mikroalgen wie
`
`Phaeodactylum tricomutum, Porphiridium-Arten, Thraustochytrien-Arten, Schizochytrien­
`Arten oder Crypthecodinium-Arten, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, wie
`
`Mortierella, Entomophthora oder Mucor und/oder Moose wie Physcomitrella, Ceratodon und
`Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K.
`Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and
`Biotechnology 73: 269-278). Durch Stammselektion ist eine Anzahl von Mutantenstämmen
`
`der entsprechenden Mikroorganismen entwickelt worden, die eine Reihe wünschenswerter
`Verbindungen, einschließlich PUF As, produzieren. Die Mutation und Selektion von Stämmen
`mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls wie den mehrfach ungesättigten
`Fettsäuren ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Mit Hilfe der vorge­
`nannten Mikroorganismen lassen sich zudem nur begrenzte Mengen der gewünschten
`mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie DPA, EP A oder ARA herstellen, die noch dazu in der
`Regel als Fettsäuregemische anfallen. Deshalb werden, wann immer möglich, gentechno­
`
`logische Verfahren bevorzugt.
`
`Höhere Pflanzen enthalten mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Linolsäure (C18:2) und
`Linolensäure (C18:3). ARA, EPA und DHA kommen im Samenöl höherer Pflanzen gar nicht
`oder nur in Spuren vor (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles V egetales. Technique &
`Documentation - Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Es wäre jedoch vorteilhaft, in
`höheren Pflanzen, bevorzugt in Ölsaaten wie Raps, Lein, Sonnenblume und Soja, LCPUF As
`herzustellen, da auf diese Weise große Mengen qualitativ hochwertiger LCPUF As für die
`
`Lebensmittelindustrie, die Tierernährung und für pharmazeutische Zwecke kostengünstig
`
`gewonnen werden können. Hierzu werden vorteilhafterweise über gentechnische Methoden
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`Gene, die für Enzyme der Biosynthese von LCPUF As kodieren, in Ölsaaten eingeführt und
`exprimiert. Dies sind Gene, die beispielsweise für A-6-Desaturasen, A-6-Elongasen, A-5-
`Desaturasen oder A-4-Desaturasen kodieren. Diese Gene können vorteilhaft aus Mikro­
`
`organismen und niederen Pflanzen isoliert werden, die LCPUF As herstellen und in den
`Membranen oder Triacylglyceriden einbauen. So konnten bereits ß-6-Desaturase-Gene aus
`dem Moos Physcomitrella patens und A-6-Elongase-Gene aus P. patens und dem Nematoden
`
`C. elegans isoliert werden.
`
`Transgene Pflanzen, die für Enzyme der LCPUF A-Biosynthese kodierende Gene enthalten
`und exprimieren und als Folge dessen LCPUF As produzieren, wurden beispielsweise in
`DE-A-102 19 203 (Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen)
`beschrieben. Diese Pflanzen produzieren allerdings LCPUF As in Mengen, die für eine
`Aufarbeitung der in den Pflanzen enthaltenen Öle noch weiter optimiert werden müssen. So
`beträgt der Gehalt von ARA in den in DE-A-102 19 203 beschriebenen Pflanzen lediglich 0,4
`bis 2% und der Gehalt von EP A lediglich 0,5 bis 1 %, jeweils bezogen auf den Gesamt­
`lipidgehalt der Pflanze.
`
`Um eine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit mehrfach ungesättigten, langkettigen
`. Fettsäuren zu ermöglichen, besteht daher ein großer Bedarf an einem einfachen, kosten­
`günstigen Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten, langkettigen Fettsäuren
`
`speziell in pflanzlichen Systemen.
`
`Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem langkettige,
`mehrfach ungesättigte Fettsäuren, insbesondere Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure
`
`und/oder Docosahexaensäure, in transgenen Pflanzen in großer Menge preiswert hergestellt
`werden können.
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`CSIRO Exhibit 1004
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`Es wurde nun überraschenderweise herausgefunden, dass durch die Expression einer
`
`optimierten AS-Elongase-Sequenz in transgenen Pflanzen die Ausbeute an langkettigen,
`mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure
`
`und/oder Docosahexaensäure, gesteigert werden kann.
`
`Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten PUF As umfassen eine Gruppe von
`Molekülen, die höhere Tiere nicht mehr synthetisieren können und somit aufnehmen müssen
`oder die höhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen können und somit zusätzlich
`aufuehmen müssen, obwohl sie leicht von anderen Organismen, wie Bakterien, synthetisiert
`
`werden können.
`
`Entsprechend wird die Aufgabe der Erfindung gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren
`zur Herstellung von Eicosapentaensäure, Doccisapentaensäure und/oder Docosahexaensäure
`in einer transgenen Pflanze, umfassend das Bereitstellen in der Pflanze von mindestens einer
`Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivität kodiert;
`mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer A6-Elongase­
`Aktivität kodiert; mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mi! einer
`.6.5-Desaturase-Aktivität kodiert; und mindestens einer Nukleinsäuresequenz, welcheJür ein
`
`Polypeptid mit einer .6.5-Elongase-Aktivität kodiert,
`wobei die Nukleinsäuresequenz, welche für ein Polypeptid mit einer .6.5-Elongase-Aktivität
`kodiert, gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz
`stammt, dadurch verändert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren
`
`Pflanzenarten angepasst ist.
`
`Das "Bereitstellen in der Pflanze" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass
`
`Maßnahmen getroffen werden, so dass die Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein
`
`Polypeptid mit einer .6..6-Desaturase-Aktivität, ein Polypeptid mit einer .6.6-Elongase­
`Aktivität, ein Polypeptid mit einer AS-Desaturase-Aktivität und ein Polypeptid mit einer AS-
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`CSIRO Exhibit 1004
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`Elongase-Aktivität zusammen in einer Pflanze vorliegen. Das "Bereitstellen in der Pflanze"
`
`umfasst somit das Einbringen der Nukleinsäuresequenzen in die Pflanze sowohl durch Trans­
`
`formation einer Pflanze mit einem oder mehreren rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die
`
`die genannten Nukleinsäuresequenzen enthalten, als auch durch Verkreuzung von geeigneten
`
`Elternpflanzen, die eine oder mehrere der genannten Nukleinsäuresequenzen enthalten.
`
`Die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer ß5-Elongase-Aktivität kodiert, ist
`erfindungsgemäß gegenüber der Nukleinsäuresequenz in dem Organismus, aus dem die
`Sequenz stammt, dadurch verändert, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder
`mehreren Pflanzenarten angepasst ist. Dies bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenz gezielt für
`die Zwecke der Erfindung optimiert wurde, ohne dass dadurch die von der
`Nukleinsäuresequenz kodierte Aminosäuresequenz verändert wurde.
`
`Der genetische Code ist redundant, da er 61 Kodons verwendet, um 20 Aminosäuren zu
`spezifizieren. Daher werden die meisten der 20 proteinogenen Aminosäuren von mehreren
`Tripletts (Kodons) kodiert. Die synonymen Kodons, die eine einzelne Aminosäure spezi­
`fizieren, werden in einem bestimmten Organismus jedoch nicht mit gleicher Häufigkeit
`
`verwendet, sondern es gibt bevorzugte Kodons, die häufig verwendet werden und Kodons, die
`seltener verwendet werden. Diese Unterschiede in der Kodonverwendung werden zurück­
`geführt auf selektive evolutionäre Drücke und vor allem die Effizienz der Translation. Ein
`Grund für die geringere Translationseffizienz von selten auftretenden Kodons könnte darin
`
`liegen", dass die entsprechenden Aminoacyl-tRNA-Pools erschöpft werden und damit nicht
`
`mehr zur Proteinsynthese zur Verfügung stehen.
`
`Außerdem bevorzugen unterschiedliche Organismen unterschiedliche Kodons. Daher läuft
`
`beispielsweise die Expression einer rekombinanten DNA, die aus einer Säugerzelle stammt,
`in E. coli-Zellen häufig nur suboptimal ab. Deshalb kann der Austausch selten verwendeter
`
`Kodons gegen häufig verwendete Kodons in manchen Fällen die Expression erhöhen. Ohne
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`an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die kodonoptimierten
`
`DNA-Sequenzen eine effizientere Translation ermöglichen und die daraus gebildeten mRNAs
`möglicherweise eine höhere Halbwertszeit in der Zelle besitzen und daher häufiger für die
`Translation zur Verfügung stehen. Aus dem vorstehend gesagten folgt, dass eine
`Kodonoptimierung nur dann nötig ist, wenn der Organismus, in dem die Nukleinsäuresequenz
`
`exprimiert werden soll, ein anderer ist als der Organismus, aus dem die Nukleinsäuresequenz
`ursprünglich stammt.
`
`Für viele Organismen, von denen die DNA-Sequenz einer größeren Zahl von Genen bekannt
`ist, gibt es Tabellen, denen man die Häufigkeit der Verwendung bestimmter Kodons in dem
`jeweiligen Organismus entnehmen kann. Mit Hilfe dieser Tabellen lassen sich Protein­
`sequenzen mit relativ großer Genauigkeit in eine DNA-Sequenz zurückübersetzen, die die
`
`im jeweiligen Organismus bevorzugten Kodons für die verschiedenen Aminosäuren des
`Proteins enthält. Tabellen zur Kodonverwendung können u.a. unter der folgenden Internet­
`Adresse aufgefunden werden:
`http://www.kazusa.or.ip/Kodon/E.html. Darüber hinaus bieten mehrere Firmen Software für
`die Genoptimierung an, wie z.B. die Firma Entelechon (Software Leto) oder die Firma
`Geneart (Software GeneOptimizer).
`
`Die Anpassung der Sequenzen an die Kodonverwendung in einem bestimmten Organismus
`kann unter Zuhilfenahme verschiedener Kriterien erfolgen. Zum einen kann für eine
`
`bestimmte Aminosäure immer das am häufigsten im ausgewählten Organismus vorkommende
`Kodon verwendet werden, zum anderen kann aber auch die natürliche Frequenz der ver­
`schiedenen Kodons berücksichtigt werden, so dass alle Kodons für eine bestimmte
`
`Aminosäure entsprechend ihrer natürlichen Häufigkeit in die optimierte Sequenz eingebaut
`
`werden. Dabei kann die Auswahl, an welcher Position welches Basen-Triplett verwendet
`wird, zufällig stattfinden. Erfindungsgemäß wurde die DNA-Sequenz unter Berücksichtigung
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`der natürlichen Häufigkeit einzelner Kodons angepasst, wobei die Verwendung des am
`
`häufigsten im ausgewählten Organismus vorkommenden Kodons ebenfalls geeignet ist.
`
`Besonders bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz aus Ostreococcus tauri, die für
`ein Polypeptid mit einer Li5-Elongase-Aktivität kodiert, zumindest an die Kodonverwendung
`in Raps, Soja und/oder Lein angepasst. Bei der ursprünglich aus Ostreococcus tauri
`stammenden Nukleinsäuresequenz handelt es sich bevorzugt um die in SEQ ID No. 13
`
`dargestellte Sequenz. Die für die Li5-Elongase kodierende DNA-Sequenz ist an mindestens
`20% der Positionen, bevorzugt an mindestens 30% der Positionen, besonders bevorzugt an
`mindestens 40% Positionen und am meisten bevorzugt an mindestens 50% der Positionen an
`die Kodonverwendung in Raps, Soja und/oder Lein angepasst.
`
`Am meisten bevorzugt handelt es sich bei der verwendeten Nukleinsäuresequenz um die in
`SEQ ID No.1 angegebene Sequenz.
`
`Es versteht sich, dass auch solche kodonoptimierten DNA-Sequenzen von der Erfindung
`erfasst sind, die für ein P<?lypeptid mit der Aktivität einer Li5-Elongase kodieren, dessen
`Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Positionen gegenüber der Wildtyp-Sequenz
`verändert ist, das aber noch im wesentlichen die gleiche Aktivität aufweist wie das Wildtyp­
`
`Protein.
`
`Bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer Li6-Desaturase­
`
`Aktivität kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
`a) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID No. 3 dargestellten Sequenz,
`
`b) Nukleinsäuresequenzen, die für die in SEQ ID No. 4 angegebene Aminosäuresequenz
`
`kodieren,
`c) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem komplementären Strang der in SEQ ID No. 3
`angegebenen Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und
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`CSIRO Exhibit 1004
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`
`d) Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID No. 3 angegebenen Sequenz zu mindestens
`60% identisch sind.
`
`(-.:.
`
`Bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer 6-6-Elongase­
`Aktivität kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
`a) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID No. 5 dargestellten Sequenz,
`b) Nukleinsäuresequenzen, die für die in SEQ ID No. 6 angegebene Aminosäuresequenz
`kodieren,
`c) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem komplementären Strang der in SEQ ID No. 5
`angegebenen Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und
`d) Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID No. 5 angegebenen Sequenz zu mindestens
`60% identisch sind.
`
`Bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer .Ll5-Desaturase­
`Aktivität kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
`
`a) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID No. 7 dargestellten Sequenz,
`b) Nukleinsäuresequenzen, die für die in SEQ ID No. 8 angegebene Aminosäuresequenz
`kodieren,
`c) Nukleinsäuresequenzen, die mit dem komplementären Strang der in SEQ ID No. 7
`angegebenen Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und
`d) Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID No. 7 angegebenen Sequenz zu mindestens
`
`60% identisch sind.
`
`Weitere geeignete Nukleinsäuresequenzen kann der Fachmann der Literatur bzw. den
`bekannten Genbanken wie z.B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov entnehmen.
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`CSIRO Exhibit 1004
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`. - 1 6 -
`
`In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden zusätzlich eine oder
`
`mehrere Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit der Aktivität einer ro-3-
`
`Desaturase und/oder einer A4-Desaturase kodieren, in die Pflanze eingebracht.
`
`Bevorzugt ist