Europaisches Patentamt
`GD1
`
`European Patent Office
`DG1
`
`Office européen des breveis
`DG1
`
`Bescheinigung
`
`Certificate
`
`Attestation
`
`Die angehefteten Unterlagen
`stimmen mit der ursprunglich
`eingereichten Fassung der
`auf dem nachsten Blatt
`bezeichneten europaischen
`Patentanmeldung Uberein.
`
`The attached documents are
`exact copies of the
`Europeanpatent application
`described on the following
`page, as originally filed.
`
`Les documentsfixés a cette
`attestation sont conformes a
`la version initialement
`déposée de la demande de
`brevet européen spécificée a
`la page suivante.
`
`Patentanmeldung Nr.
`
`Patent application No.
`
`Demande de brevet n°
`
`06120309.7 / EP06120309
`
`The organization code and number of your priority application, to be used for filing abroad under the Paris
`Convention, is EP06120309
`
`Der Prasident des Europaischen Patentamts;
`Im Auftrag
`For the President of the European Patent Office
`Le President de l’Office européen des brevets
`p.o.
`
`R.C. van Dijk
`
`AFO02090
`EPA/EPO/OEB Form 1014=02.00
`CSIRO Exhibit 1005
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`CSIRO Exhibit 1005
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`Europaisches Patentamt
`GD1
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`European Patent Office
`DG1
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`Office européen des brevets
`DG1
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`Anmeidetag:
`Dateoffiling:
`Date de dépét:
`
`07.09.06
`
`Anmeldung Nr:
`Application no.:
`Demande no:
`
`06120309.7
`
`Anmelder/Applicant(s)/Demandeur(s):
`
`BASF Plant Science GmbH
`Carl-Bosch-Strasse 64
`67117 Limburgerhof/DE
`
`Bezeichnung der Erfindung/Title of the invention/Titre de I'invention:
`(Falls die Bezeichnung der Erfindung nicht angegebenist, siehe Beschreibung.
`If no title is shown please refer to the description.
`Si aucun titre n'est indiqué se referer 4 la description.)
`
`Verfahren zur Herstellung von mehrfach unges@itigten Fettsauren
`
`In anspruch genommenePrioritat(en) / Priority(ies) claimed / Priorité(s) revendiquée(s)
`Staat/Tag/Aktenzeichen / State/Date/File no. / Pays/Date/Numéro de dépét:
`
`Internationale Patentklassifikation / International Patent Classification / Classification internationale de brevets:
`
`C12N1/00
`
`Am Anmeldetag benannte Vertragstaaten / Contracting states designated at dateoffiling / Etats contractants désignées lors du dépdt:
`
`AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LILT LU LV MC NL PL PT ROSE SI SK TR
`
`EPA/EPO/OEB Form 1014
`
`02.00
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`CSIRO Exhibit 1005
`CSIRO Exh®it 1005
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`Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesattigten Fettsauren
`
`Die vorliegende Ertindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaensaure,
`
`Docosapentaensaure und/oder Docosahexaensdaurein transgenen Pflanzen, indem in
`
`der Pflanze bereitgestellt werden mindestens eine Nukleinsauresequenz, welche fur ein
`
`Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitat kodiert; mindestens eine Nuklein-
`
`sauresequenz, welcheflr ein Polypeptid mit einer A6-Elongase-Aktivitat kodiert; mindes-
`
`tens eine Nukleinsauresequenz, welche flr ein Polypeptid mit einer A5-Desaturase-
`
`Aktivitat kodiert; und mindestens eine Nukleinsauresequenz, welche fur ein Polypeptid
`
`10
`
`mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert,
`
`wobei die Nukleinsauresequenz, welche fur ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-
`
`Aktivitat kodiert, gegentiber der Nukleinsauresequenz in dem Organismus, aus dem die
`
`Sequenz stammt, dadurch veradndert ist, dass sie an die Kodonverwendungin einer oder
`
`mehreren Pflanzenarten angepasstist.
`
`15
`
`In einer bevorzugten AusfUhrungsform werden zusatzlich weitere Nukleinsaure-
`
`sequenzen, die fur ein Polypeptid mit der Aktivitat einer wW3-Desaturase und/oder ei-
`
`ner A4-Desaturase kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`20
`
`In einer weiteren bevorzugten Ausfthrungsform werden weitere Nukleinsauresequenzen,
`
`die fur Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acy!-ACP(= acyl carrier protein)-Desaturase(n),
`
`Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsaure-Acyl—Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-
`
`Acyltransferase(n), Fettsaure-Synthase(n), Fettsaure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym
`
`A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsaure-Desaturase(n), Fettsaure—
`
`25
`
`Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol—Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydrope-
`
`roxid—Lyasen oder Fettsaure—Elongase(n) kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Nukleinsduremolektle, umfassend mindes-
`
`tens eine Nukleinsauresequenz,die fur ein Polypeptid mit einer AG-Desaturase-Aktivitat
`
`30
`
`kodiert; mindestens eine Nukleinsauresequenz, die fur ein Polypeptid mit einer A5-
`
`AE20060780 WiIL/kos, 06.09.06
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`Desaturase-Aktivitat kodiert; mindestens eine Nukleinsauresequenz, die fur ein Polypep-
`
`tid mit einer AG-Elongase-Aktivitat kodiert; und mindestens eine Nukieinsauresequenz,
`
`die fur ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert und die gegenUber der Nuk-
`
`leinsauresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch verandert
`
`ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst
`
`ist.
`
`Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Ole, Lipide und/oder Fettsauren, die nach dem
`
`erfindungsgemafen Verfahren hergestellt wurden, und deren Verwendung.
`
`10
`
`SchlieBlich betrifft die Erfindung auch transgene Pflanzen, die nach dem erfindungs-
`
`gemafsen Verfahren hergestellt wurden oderdie ein erfindungsgemafes rekombinantes
`
`Nukleinsauremolekul enthaiten, und deren Verwendung als Nahrungs- oder Futtermittel.
`
`15
`
`Die Lipidsynthese lasst sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsauren
`
`und ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer
`polaren Kopfgruppe. Ubliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen
`
`Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsauresynthese
`
`beginnt mit der Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-
`
`20
`
`Carboxylase oder in Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensati-
`
`onsreaktion bilden diese beiden Produktmolektle zusammen Acetoacetyl-ACP, das Uber
`
`eine Reihe von Kondensations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umge-
`
`wandelt wird, so dass ein gesattigtes Fettsauremolekul mit der gewUnschten Kettenlange
`
`erhalten wird. Die Produktion der ungesattigten Fettsauren aus diesen Molekulen wird
`
`25
`
`durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekula-
`
`rem Sauerstoff oder anaerob (beziglich der Fettsauresynthese in Mikroorganismensie-
`
`he F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., S.
`
`612-636 und darin enthaltene Literaturstellen; Lengeler et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of
`
`Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie
`
`30
`
`Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 und die enthaltenen
`
`Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide gebundenen Fettsduren mussen
`
`anschliefend fur die weiteren Elongationen aus den Phospholipiden wiederin den Fett-
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`saureCoA-Ester-Pool Uberfthrt werden. Dies erméglichen Acyl-CoA:Lysophospholipid-
`
`Acyltransferasen. Weiterhin kGnnen diese Enzyme die elongierten Fettsauren wieder
`
`von den CoA-Estern auf die Phospholipide ubertragen. Diese Reaktionsabfolge kann
`
`gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.
`
`Ferner mussen Fettsauren anschlieRBend an verschiedene Modifikationsorte transportiert
`
`und in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt
`
`bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsauren auf die polaren Kopfgruppen, bei-
`
`spielsweise durch Glycerin-Fettsaure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid,
`
`10
`
`100(4-5):161-166).
`
`Eine Ubersicht ber die Pflanzen-Fettsdaurebiosynthese, Desaturierung, den Lipid-
`
`stoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation,
`
`Fettsauremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und —Assemblierung
`
`15
`
`geben einschliefglich der Literaturstellen die folgenden Artikel: Kinney (1997) Genetic
`
`Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge und Browse (1995) Plant Cell
`
`7:957-970; Shanklin und Cahoon (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
`
`49:61 1-641; Voelker (1996) Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:111-13;
`
`Gerhardt (1992) Prog. Lipid R. 31:397-417; Gdhnemann-Schafer & Kind! (1995) Biochim.
`
`20
`
`Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al. (1995) Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et
`
`al. (1993) in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of
`
`Plants, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiolo-
`
`gists, 150-158; Murphy & Ross (1998) Plant Journal. 13(1):1-16.
`
`25
`
`Die mehrfach ungesattigten Fettsauren k6nnen entsprechend ihrem Desaturierungs-
`
`muster in zwei grofse Klassen, die w-6- und die w-3-Fettsauren, eingeteilt werden, die
`
`metabolisch und funktionell unterschiedliche Aktivitaten haben.
`
`Im Folgenden werden mehrfach ungesattigte Fettsauren als PUFA, PUFAs, LCPUFA
`
`oder LCPUFAs bezeichnet(poly unsaturated fatty acids, PUFA, mehrfach ungesattigte
`
`30
`
`Fettsauren; long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach un-
`
`gesattigte Fettsauren).
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`Als Ausgangsstoff flr den w-6-Stoffwechselweg fungiert die Fettsaure Linolsaure
`
`(18:249.12), wahrend der w-3-Weg Uber Linolensdure (18:349.'2.15) ablauft. Linolensaure
`
`wird dabei durch die Aktivitat einer w-3-Desaturase aus Linolsaure gebildet (Tocheretal.
`
`(1998) Prog. Lipid Res. 37: 73-117 ; Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 4105-
`
`4113).
`
`Saugetiere und damit auch der Menschverfiigen Uber keine entsprechende Desaturase-
`
`aktivitat (A-12- und w-3-Desaturase) zur Bildung dieser Ausgangsstoffe und mussen da-
`her diese Fettsduren (essentielle Fettsauren) liber die Nahrung aufnehmen. Uber eine
`
`10
`
`Abfolge von Desaturase- und Elongase-Reaktionen werden dann aus diesen Vorstufen
`
`die physiologisch wichtigen mehrfach ungesattigten Fettsauren Arachidonsaure (= ARA,
`
`20:445.8.11,14), eine w-6-Fettsaure und die beiden w-3-Fettsauren Eicosapentaen- (= EPA,
`
`20:545.8.11.14.17) und Docosahexaensaure (DHA, 22:644,7.10.13.17,19) synthetisiert.
`
`15
`
`Die Verlangerung von Fettsauren durch Elongasen um 2 bzw. 4 C-Atome ist fiir die Pro-
`
`duktion von Cao- bzw. C22-PUFAs von entscheidender Bedeutung. Dieser Prozess ver-
`
`lauft Uber 4 Stufen. Den ersten Schritt stellt die Kondensation von Malonyl-CoA an das
`
`Fettsaure-Acyl-CoA durch die Ketoacyl-CoA-Synthase (KCS, im weiteren Text als Elon-
`
`20
`
`gase bezeichnet) dar. Es folgt dann ein Reduktionsschritt (Ketoacyl-CoA-Reduktase,
`
`KCR), ein Dehycratationsschritt (Dehydratase) und ein abschlieRender Reduktionsschritt
`
`(Enoyl-CoA-Reduktase). Es wurde postuliert, dass die Aktivitat der Elongase
`
`die Spezifitat und Geschwindigkeit des gesamten Prozessesbeeinflusst (Millar and
`
`Kunst (1997) Plant Journal 12:121-131).
`
`25
`
`Fur Fettsauren und Triacyiglyceride besteht eine Vielzahl von Anwendungen in der Le-
`
`bensmittelindustrie, der Tierernahrung, der Kosmetik und im Pharmabereich.
`
`Je nachdem, ob es sich um freie gesattigte und ungesattigte Fettsauren oder um Tria-
`
`cylglyceride mit einem erhdhten Gehalt an gesattigten oder ungesattigten Fettsauren
`
`30
`
`handelt, sind sie fur die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet. So werden z.B. in
`
`der humanen Ernahrung Lipide mit ungesattigten, speziell mehrfach ungesattigten, Fett-
`
`sauren bevorzugt. Den mehrfach ungesattigten w-3-Fettsauren wird dabei ein positiver
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`Effekt auf den Choiesterinspiegel im Blut und damit auf die Pravention einer Herzerkran-
`
`kung zugeschrieben. Durch Zugabe dieser w-3-Fettsauren zur Nahrung kann dasRisiko
`
`einer Herzerkrankung, eines Schlagantalls oder von Bluthochdruck deutlich verringert
`
`werden (Shimikawa (2001) World Rev. Nutr. Diet. 88: 100-108).
`
`Auch entzundliche, speziell chronisch entzundliche, Prozesse im Rahmen immuno-
`
`logischer Erkrankungen wie rheumatoiderArthritis lassen sich durch w-3-Fettsauren po-
`
`sitiv beeinflussen (Calder (2002) Proc. Nutr. Soc. 61: 345-358; Cleland und James
`
`(2000) J. Rheumatol. 27: 2305-2307). Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell didte-
`
`10
`
`tischen Lebensmitteln, zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung.
`
`u)-6-Fettsauren wie Arachidonsdure Uben bei diesen rheumatischen Erkrankungen e-
`
`her einen negativen Effekt aus.
`
`Ww-3- und w-6-Fettsauren sind Vorlaufer von Gewebshormonen, den sogenannten
`
`15
`
`Eicosanoiden wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo-y-linolensdaure,
`
`der Arachidonsaure und der Eicosapentaensaure ableiten, und den Thromboxanen und
`
`Leukotrienen, die sich von der Arachidonsdaure und der Eicosapentaensdure ableiten.
`
`Eicosanoide (sog. PG2-Serie), die aus w-6-Fettsauren gebildet werden, fordern in
`
`der Regel EntzUndungsreaktionen, wahrend Eicosanoide (sog. PG3-Serie} aus w-3-
`
`20
`
`Fettsauren geringe oder keine entzUndungsfdordernde Wirkung haben.
`
`Mehriach ungesattigte langkettige w-3-Fettsauren wie Eicosapentaensdure (= EPA,
`
`C20:545.8,11,14.17) oder Docosahexaensaure (= DHA, C22:644.7.19.13.16,13) sind wichtige
`
`Komponenten der menschlichen Ernahrung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in der
`
`25
`
`Gesundheit, die Aspekte wie die Entwicklung des kindlichen Gehirns, die Funktionailitat
`
`des Auges, die Synthese von Hormonen und anderer Signalstoffe, sowie die Vorbeu-
`
`gung von Herz-Kreislauf-Beschwerden, Krebs und Diabetes umfassen (Poulos, A (1995)
`
`Lipids 30:1-14; Horrocks, LA und Yeo YK (1999) Pharmacol Res 40:211-225).
`
`30
`
`Aufgrund der heute Ublichen Zusammensetzung der menschlichen Nahrungist ein Zu-
`
`satz von mehrfach ungesattigten w-3-Fettsauren, die bevorzugt in Fischdélen vorkom-
`
`men, zur Nahrung besonders wichtig. So werden beispielsweise mehrfach ungesattigte
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`Fettsauren wie Docosahexaensdaure (= DHA, C22:644,7.10.13,16.18) oder Eisosapentaensau-
`
`re (= EPA, ©20:545.8.11,14.17) der Babynahrung zur Erhéhung des Nahrwertes zugesetzt.
`
`Es besteht aus diesem Grund ein Bedarf an der Produktion mehrfach ungesattigter lang-
`
`kettiger Fettsauren.
`
`Hauptsachlich werden die verschiedenen Fettsauren und Triglyceride aus Mikro-
`organismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Ol-produzierenden Pflanzen
`
`wie Soja, Raps und Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum und weiteren ge-
`
`wonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Tri-
`
`10
`
`glycerole) anfallen. Sie k6nnen aber auch aus Tieren wie z.B. Fischen gewonnen wer-
`
`15
`
`20
`
`den. Die freien Fetts@uren werden vorteilhaft durch Verseifung der Triacylglyceride her-
`
`gestellt. Sehr langkettige mehrfach ungesattigte Fettsauren wie DHA, EPA, Arachidon-
`
`saure (ARA, C20:445.8.11.14), Dihomo-y-linolensaure (DHGL, C20:348.11.14) oder Docosa-
`pentaensaure (DPA, C22:547.10,13.16,19) werden in Olfruchtpflanzen wie Raps, Soja, Son-
`nenblume, Farbersaflor jedoch nicht synthetisiert. Ubliche natiirliche Quellen flr diese
`
`Fettsauren sind Fische wie Hering, Lachs, Sardine, Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle,
`
`Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch oder Algen.
`
`Aufgrund der positiven Eigenschaften der mehrfach ungesattigten Fettsauren hat es in
`
`der Vergangenheit nicht an Ansatzen gefehit, Gene, die an der Synthese dieser Fettsau-
`ren bzw. Triglyceride beteiligt sind, fur die Herstellung von Olen in verschiedenen Orga-
`
`nismen mit geandertem Gehalt an ungesattigten Fettsduren verfigbar zu machen. So
`wird in WO 91/13972 und seinem US—Aquivalent eine A-9—Desaturase beschrieben. In
`
`WO 93/11245 wird eine A-15—Desaturase und in WO 94/11516 eine A-12-Desaturase
`
`25
`
`beansprucht. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP—A-0 550 162,
`
`WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey
`
`et al. (1990) J. Biol. Chem., 265: 20144-20149, Wada et al. (1990) Nature 347: 200-203
`
`oder Huang etal. (1999) Lipids 34: 649-659 beschrieben. Die biochemische Charakteri-
`
`sierung der verschiedenen Desaturasenist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da
`
`30
`
`die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwerzu isolieren und zu cha-
`
`rakterisieren sind (McKeon etal. (1981) Methods in Enzymol. 71: 12141-12147, Wang et
`
`al. (1988) Plant Physiol. Biochem., 26: 777-792).
`
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`
`In der Regel erfolgt die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen durch Ein-
`
`bringung in einen geeigneten Organismus, der anschlieRend auf Enzymaktivitat mittels
`
`Edukt- und Produktanalyse untersucht wird. A-6—Desaturasen werden in WO 93/06712,
`
`US 5,614,393, WO 96/21022, WO 00/21557 und WO 99/27111 beschrieben. Die An-
`
`wendung dieses Enzyms zur Produktion von Fettsauren in transgenen Organismen wird
`
`in WO 98/46763, WO 98/46764 und WO 98/46765 beschrieben. Die Expression ver-
`
`schiedener Desaturasen und die Bildung mehrfach ungesattigter Fettsauren wird auchin
`
`WO 99/64616 oder WO 98/46776 beschrieben und beansprucht. Bzgl. der Effektivitat
`
`10
`
`der Expression von Desaturasen und ihrem Einfluss auf die Bildung mehrfach ungesat-
`
`tigter Fettsauren ist anzumerken, dass durch Expression einer einzelnen Desaturase wie
`
`bisher beschrieben lediglich geringe Gehalte an ungesattigten Fettsauren/Lipiden wie
`
`z.B. y-Linolensaure und Stearidonsaure erreicht wurden.
`
`15
`
`In der Vergangenheit wurden zahireiche Versuche unternommen, Elongase-Gene
`
`zu erhalten. Millar and Kunst (1997) Plant Journal 12:121-131 und Millar et al. (1999)
`
`Plant Cell 11:825-838 beschreiben die Charakterisierung von pflanzlichen Elongasen zur
`
`Synthese von einfach ungesattigten langkettigen Fettsauren (C22:1) bzw. zur Synthese
`
`von sehr langkettigen Fettsauren fur die Wachsbildung in Pflanzen (C2zg-C32}. Beschrei-
`
`20
`
`bungen zur Synthese von Arachidonsaure und EPAfinden sich beispielsweise in WO
`
`01/59128, WO 00/12720, WO 02/077213 und WO 02/08401. Die Synthese von mehrfach
`
`ungesattigter C24-Fettsauren ist beispielsweise in Tvrdik et al. (2000) J. Cell Biol. 149:
`
`707-718 oder in WO 02/44320 beschrieben.
`
`25
`
`Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAssind Mikroalgen wie
`
`Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-Arten, Thraustochytrien-Arten, Schizochytrien-
`
`Arten oder Crypthecodinium-Arten, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, wie
`
`Mortierella, Entomophthora oder Mucor und/oder Moose wie Physcomitrella, Ceratodon
`
`und Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Tota-
`
`30
`
`ni & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry
`
`and Biotechnology 73: 269-278). Durch Stammselektion ist eine Anzahl von Mutanten-
`
`stammen der entsprechenden Mikroorganismen entwickelt worden, die eine Reihe wun-
`
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`8
`
`schenswerter Verbindungen, einschlieRlich PUFAs, produzieren. Die Mutation
`
`und Selektion von Stammen mit verbesserter Produktion eines bestimmten Molekils wie
`
`den mehrfach ungesattigten Fettsauren ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges
`
`Verfahren. Mit Hilfe der vorgenannten Mikroorganismen lassen sich zudem nur begrenz-
`
`te Mengen der gewtnschten mehrfach ungesattigten Fettsauren wie DPA, EPA oder
`
`ARAhersteillen, die noch dazu in der Regel als Fettsauregemische anfallen. Deshalb
`
`werden, wann immer méglich, gentechnologische Verfahren bevorzugt.
`
`H6éhere Pflanzen enthalten mehrfach ungesattigte Fettsauren wie Linolsaure (C18:2) und
`
`10
`
`Linolensdure (C18:3). ARA, EPA und DHA kommen im Samenol hdherer Pflanzen gar
`
`nicht oder nur in Spuren vor (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales.
`
`Technique & Documentation — Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Es ware jedoch
`vorteilhaft, in hGheren Pflanzen, bevorzugt in Olsaaten wie Raps, Lein, Sonnenblume
`
`und Soja, LCPUFAs herzustellen, da auf diese Weise grof&e Mengen qualitativ hochwer-
`
`15
`
`tiger LCPUFAsftir die Lebensmittelindustrie, die Tierernahrung und fur pharmazeutische
`
`Zwecke kostengUinstig gewonnen werden kdonnen. Hierzu werden vorteilhafterweise Uber
`
`gentechnische Methoden Gene, die fur Enzyme der Biosynthese von LCPUFAskodie-
`ren, in Olsaaten eingefiihrt und exprimiert. Dies sind Gene, die beispielsweise flr A-6-
`
`Desaturasen, A-6-Elongasen, A-5-Desaturasen oder A-4-Desaturasen kodieren. Diese
`
`20
`
`Gene k6nnen vorteilhaft aus Mikroorganismen und niederen Pflanzen isoliert werden, die
`
`LCPUFAsherstellen und in den Membranen oder Triacylglyceriden einbauen. So konn-
`
`ten bereits A-6-Desaturase-Gene aus dem Moos Physcomitrella patens und A-6-
`
`Elongase-Gene aus P. patens und dem Nematoden C. elegans isoliert werden.
`
`25
`
`TransgenePflanzen, die fur Enzyme der LCPUFA-Biosynthese kodierende Gene enthal-
`
`ten und exprimieren und als Folge dessen LCPUFAsproduzieren, wurden beispielswei-
`
`se in DE-A-102 19 203 (Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesattigter Fettsauren in
`
`Pflanzen) beschrieben. Diese Pflanzen produzieren allerdings LCPUFAsin Mengen, die
`fiir eine Aufarbeitung der in den Pflanzen enthaltenen Ole noch weiter optimiert werden
`
`30
`
`mussen. So betragt der Gehalt von ARA in den in DE-A-102 19 203 beschriebenen
`
`Pflanzen lediglich 0,4 bis 2% und der Gehalt von EPAlediglich 0,5 bis 1%, jeweils bezo-
`
`gen auf den Gesamtlipidgehalt der Pflanze.
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`Um eine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit mehrfach ungesattigten, lang-
`
`kettigen Fettsauren zu ermdglichen, besteht daher ein gro&er Bedarf an einem einfa-
`
`chen, kostengtinstigen Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesattigten, langketti-
`
`gen Fettsauren speziell in pflanzlichen Systemen.
`
`Eine Aufgabe der Erfindungist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem langket-
`
`tige, mehrfach ungesattigte Fettsauren, insbesondere Eicosapentaensdaure, Docosapen-
`
`taensaure und/oder Docosahexaensaure, in transgenen Pflanzen in groRer Menge
`
`10
`
`preiswert hergestellt werden k6nnen.
`
`Es wurde nun Uberraschenderweise herausgefunden, dass durch die Expression einer
`
`optimierten A5-Elongase-Sequenzin transgenen Pflanzen die Ausbeute an langkettigen,
`
`mehrfach ungesattigten Fettsauren, insbesondere Eicosapentaensaure, Docosa-
`
`15
`
`pentaensaure und/oder Docosahexaensaure, gesteigert werden kann.
`
`Die durch das erfindungsgemake Verfahren hergestellten PUFAs umfassen eine Gruppe
`
`von Molektlen, die héhere Tiere nicht mehr synthetisieren k6nnen und somit aufnehmen
`
`mussen oder die hdhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen kOnnen und so-
`
`20
`
`mit zusatzlich aufnehmen mussen, obwohlsie leicht von anderen Organismen, wie Bak-
`
`terien, synthetisiert werden kénnen.
`
`Entsprechend wird die Aufgabe der Erfindung gelést durch das erfindungsgemafRe Ver-
`
`fahren zur Herstellung von Eicosapentaensaure, Docosapentaensaure und/oder Doco-
`
`25
`
`sahexaensaure in einer transgenen Pflanze, umfassend das Bereitstellen in der Pflanze
`
`von mindestens einer Nukleinsauresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A6-
`
`Desaturase-Aktivitat kodiert; mindestens einer Nukleinsauresequenz, welche fur ein Po-
`
`lypeptid mit einer AG-Elongase-Aktivitat kodiert; mindestens einer Nukleinsduresequenz,
`
`welcheflr ein Polypeptid mit einer A5-Desaturase-Aktivitat kodiert; und mindestens einer
`
`30
`
`Nukleinsauresequenz, welche fur ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert,
`
`wobeidie Nukleinsauresequenz, welchefiir ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-
`
`Aktivitat kodiert, gegenuber der Nukleinsauresequenz in dem Organismus, aus dem die
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`Sequenz stammt, dadurch verandert ist, dass sie an die Kodonverwendungin einer oder
`
`mehreren Pflanzenarten angepasstist. Fur die Produktion von DHA muss desweiteren
`
`mindestens eine Nukleinsauresequenz, welche fur ein Polypeptid mit einer A4-
`
`Desaturase-Aktivitat kodiert, in der Pflanze bereitgestellt werden.
`
`Das "Bereitstellen in der Pflanze” bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass
`
`Maf&nahmen getroffen werden, so dass die Nukleinsauresequenzen kcdierend fur ein
`
`Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitat, ein Polypeptid mit einer AG-Elongase-
`
`Aktivitat, ein Polypeptid mit einer A5-Desaturase-Aktivitat und ein Polypeptid mit einer
`
`10
`
`A5-Elongase-Aktivitat zusammen in einer Pflanze vorliegen. Das "Bereitstellen in der
`
`Pflanze" umfasst somit das Einbringen der Nukleinsauresequenzen in die Pflanze so-
`
`wohl durch Transformation einer Pflanze mit einem oder mehreren rekombinanten Nuk-
`
`leinsauremolektulen, die die genannten Nukleinsduresequenzen enthalten, als auch
`
`durch Verkreuzung von geeigneten Elternpflanzen, die eine oder mehrere der genannten
`
`15
`
`Nukleinsauresequenzen enthalten.
`
`Die Nukleinsauresequenz, die fur ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert,
`
`ist erfindungsgemak gegentiber der Nukleinsauresequenz in dem Organismus, aus dem
`
`die Sequenz stammt, dadurch verdncert, dass sie an die Kodonverwendungin einer o-
`
`20
`
`der mehreren Pflanzenarten angepasstist. Dies bedeutet, dass die Nukleinsaurese-
`
`quenz gezielt fur die Zwecke der Erfindung optimiert wurde, ohne dass dadurch die von
`
`der Nukleinsauresequenz kodierte Aminosauresequenz verandert wurde.
`
`Der genetische Code ist redundant, da er 61 Kodons verwendet, um 20 Aminosauren zu
`
`25
`
`spezifizieren. Daher werden die meisten der 20 proteinogenen Aminosauren von mehre-
`
`ren Tripletts (Kodons) kodiert. Die synonymen Kodons, die eine einzelne Aminosaure
`
`spezifizieren, werden in einem bestimmten Organismus jedoch nicht mit gleicher Haufig-
`
`keit verwendet, sondern es gibt bevorzugte Kodons, die haufig verwendet werden und
`
`Kodons, die seltener verwendet werden. Diese Unterschiede in der Kodonverwendung
`
`30
`
`werden zuruckgefthrt auf selektive evolutionare Driicke und vor allem die Effizienz der
`
`Translation. Ein Grund fur die geringere Translationseffizienz von selten auftretenden
`
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`Kodons kénnte darin liegen, dass die entsprechenden Aminoacyl-tRNA-Pools erschépit
`
`werden und damit nicht mehr zur Proteinsynthese zur Verfigung stehen.
`
`11
`
`AuRerdem bevorzugen unterschiedliche Organismen unterschiedliche Kodons. Daher
`
`lauft beispielsweise die Expression einer rekombinanten DNA,die aus einer Saugerzelle
`
`stammt, in E. coli-Zellen haufig nur suboptimal ab. Deshalb kann der Austausch selten
`
`verwendeter Kodons gegen haufig verwendete Kodons in manchen Fallen die Expressi-
`
`on erhéhen. Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass
`
`die kodonoptimierten DNA-Sequenzen eine effizientere Translation ermdglichen und die
`
`10
`
`daraus gebildeten mRNAs méglicherweise eine héhere Halbwertszeit in der Zelle besit-
`
`zen und daher hdufiger fur die Translation zur Verfugung stehen. Aus dem vorstehend
`
`gesagtenfolgt, dass eine Kodonoptimierung nur dann notig ist, wenn der Organismus, in
`
`dem die Nukleinsauresequenz exprimiert werden soll, ein anderer ist als der Organis-
`
`mus, aus dem die Nukleinsauresequenz urspringlich stammt.
`
`15
`
`Fur viele Organismen, von denen die DNA-Sequenz einer gréeren Zahl von Genen be-
`
`kanntist, gibt es Tabellen, denen man die Haufigkeit der Verwendung bestimmter Ko-
`
`dons in dem jeweiligen Organismus entnehmenkann. Mit Hilfe dieser Tabellen lassen
`
`sich Proteinsequenzen mit relativ gro&er Genauigkeit in eine DNA-Sequenz zurtck-
`
`20
`
`Ubersetzen, die die im jeweiligen Organismus bevorzugten Kodonsftir die verschiedenen
`
`Aminosdauren des Proteins enthalt. Tabellen zur Kodonverwendung k6nnen u.a. unter
`
`der folgenden Internet-Adresse aufgefunden werden:
`
`http/Avwww.kazusa.or.jp/Kodon/E.himl. Daruber hinaus bieten mehrere Firmen Software
`
`fur die Genoptimierung an, wie z.B. die Firma Entelechon (Software Leto) oder die Firma
`
`25
`
`Geneart (Software GeneOptimizer).
`
`Die Anpassung der Sequenzen an die Kodonverwendungin einem bestimmten Orga-
`
`nismus kann unter Zuhilfenahme verschiedenerKriterien erfolgen. Zum einen kann fur
`
`eine bestimmte Aminosdure immer das am haufigsten im ausgewahlten Organismus
`
`30
`
`vorkommende Kodon verwendet werden, zum anderen kann aber auch die nattrliche
`
`Frequenz der verschiedenen Kodons bericksichtigt werden, so dass alle Kodonsfir ei-
`
`ne bestimmte Aminosaure entsprechend ihrer naturlichen Haufigkeit in die optimierte
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`Sequenz eingebaut werden. Dabei kann die Auswahl, an welcher Position welches Ba-
`
`sen-Triplett verwendetwird, zufallig stattfinden. Erfindungsgemaf wurde die DNA-
`
`Sequenz unter Bericksichtigung der natUrlichen Haufigkeit einzelner Kodons angepasst,
`
`wobei die Verwendung des am haufigsten im ausgewahlten Organismus vorkommenden
`
`Kodonsebenfalls geeignetist.
`
`Besonders bevorzugt ist eine Nukleinsauresequenz aus Ostreococcustauri, die fir
`
`ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitat kodiert, wie beispielsweise das in Seq ID
`
`No. 110 dargestellte Polypeptid, zumindest an die Kodonverwendung in Raps, Soja
`
`10
`
`und/oder Lein angepasst. Bei der ursprtinglich aus Ostreococcus tauri stammenden Nuk-
`
`leinsauresequenz handeit es sich bevorzugt um die in Seq ID No. 109 )dargestellte Se-
`
`quenz.Die flr die A5-Elongase kodierende DNA-Sequenzist an mindestens 20% der
`
`Positionen, bevorzugt an mindestens 30% der Positionen, besonders bevorzugt an min-
`
`destens 40% Positionen und am meisten bevorzugt an mindestens 50% der Positionen
`
`15
`
`an die Kodonverwendungin Raps, Soja und/oder Lein angepasst.
`
`Am meisten bevorzugt handelt es sich bei der verwendeten Nukleinsauresequenz um die
`
`in SEQ ID No. 64 angegebene Sequenz.
`
`20
`
`Es versteht sich, dass auch solche kodonoptimierten DNA-Sequenzen von der Erfindung
`
`erfasst sind, die fur ein Polypeptid mit der Aktivitat einer A5-Elongase kodieren, dessen
`
`Aminosauresequenz an einer oder mehreren Positionen gegentber der Wildtyp-Sequenz
`
`verandert ist, das aber noch im wesentlichen die gleiche Aktivitat aufweist wie das Wild-
`
`typ-Protein.
`
`25
`
`Bevorzugtist die Nukleinsauresequenz, die fur ein Polypeptid mit einer A6-Desaturase-
`
`Aktivitat kodiert, ausgewahit aus der Gruppe bestehend aus:
`
`a) Nukleinsauresequenzen mit derin Seq ID NO.
`
`1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27 ,29,31,33,35,37,39 oder 41, bevorzugt mit der in
`
`30
`
`Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz,
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`b) Nukleinsauresequenzen, die fur die in Seq ID No.
`
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`2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 26 ,28,30,32,34,36,38,40 oder 42, bevorzugt in Seq ID
`
`No. 2 angegebene Aminosauresequenz kodieren,
`
`c) Nukleinsauresequenzen, die mit dem komplementadren Strang der a) oder b) oberhalb
`
`angegebenen Nukleinsauresequenzen, insbesondere der in Seq ID No. 1 angegebenen
`
`Nukleinsauresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren,
`
`d) Nukleinsauresequenzen, die zu den in a) oder b) oberhalb angegebenen Nukleinsau-
`
`resequenzen, insbeondere zur der in Seq ID No. 1 angegebenen Sequenz zu mindes-
`
`tens 60%, 65%, 70%, 75% oder 80%, bevorzugt zu mindestens 81%, 82%, 83%, 84%,
`
`10
`
`85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, besonders bevorzugt zu mindestens 91%, 92%,
`
`93%, 94% oder 95% und insbesondere zu mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% iden-
`
`tisch sind, und
`
`e) Nukleinsauresequenzen, die fur eine Aminosauresequenz kodieren, die mindestens
`
`eines, beispielsweise 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, vorzugsweise alle der in Seq ID No.
`
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`
`43,44,45,46,47,48,49 oder 50 angegebenen Aminosdurepattern aufweisen.
`
`Unter Aminosaurepattern sind kurze Aminosauresequenzen zu verstehen, die vorzugs-
`
`weise weniger als 50, besonders bevorzugt weniger als 40 und insbesondere von 10 bis
`
`40 und noch weiter bevorzugt von 10 bis 30 Aminosauren umfassen.
`
`Fur die vorliegende Erfindung wird die Identitat vorzugsweise Uber die Vollange der er-
`
`findungsgemafen Nukieotid- oder Aminosauresequenzen ermittelt, beispielsweise fur
`
`die in SEQ ID NO: 64 angegebene Nukleinsauresequenz Uber die Vollange von 903
`
`Nukleotiden.
`
`20
`
`25
`
`Bevorzugtist die Nukleinsauresequenz, die fur ein Polypeptid mit einer AG6-Elongase-
`
`Aktivitat kKodiert, ausgewahit aus der Gruppe bestehend aus:
`
`a) N