(12) NACH DEM VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ZUSAMMENARBEIT AUF DEM GEBIET DES
`PATENTWESENS (PCT) VEROFFENTLICHTE INTERNATIONALE ANMELDUNG
`
` .,
`
`(10) Internationale Veroffentlichungsnummer
`
`WO 2007/096387 A1
`
`(19) Weltorganisation fiir geistiges Eigentum
`Internationales Bfiro
`
`(43) Internationales Veroffentlichungsdatum
`30. August 2007 (30.08.2007)
`
`(51) Internationale Patentklassifikation:
`CIZN 15/82 (2006.01)
`
`(21) Internationales Aktenzeichen:
`
`PCT/EP2007/05 1675
`
`(22) Internationales Anmeldedatum:
`21. Februar 2007 (21.02.2007)
`
`(25) Einreichungssprache:
`
`(26) Veroffentlichungssprache:
`
`(30) Angaben zur Prioritat:
`10 2006 008 030.0
`
`Deutsch
`
`Deutsch
`
`061203097
`
`21. Februar 2006 (21.02.2006)
`7. September 2006 (07.09.2006)
`
`DE
`EP
`
`(71) Anmelder (ffir alle Bestimmungsstaaten mit Ausnahme
`van US): BASF PLANT SCIENCE [DE/DE]; BPS — A30,
`67056 Ludwigshafen (DE).
`
`(72)
`(75)
`
`Erfinder; und
`(nur fiir US): CIRPUS, Petra
`Erfinder/Anmelder
`[DE/DE]; Landteilstrasse 12, 68163 Mannheim (DE).
`BAUER, Jorg [DE/DE]; Maxburgstrasse 6, 67117 Lim—
`burgerhof (DE). QIU, Xiao [CA/CA]; 403 Kendardine
`Road, Saskatoon, Saskatchewan S7N 3S5 (CA). WU,
`Guohai
`[CA/CA]; 2103 Kendardine Road, Saskatoon,
`Saskatchewan S7N 3S5 (CA). CHENG, Bifang [CA/CA];
`Pbi, 110 Gymnasium Road, Saskatoon, Saskatchewan
`S7N 0W9 (CA). TRUKSA, Martin [CA/CA]; 110 Gym—
`nasium Road, Saskatoon, Saskatchewan S7N 0W9 (CA).
`WETJEN, Ton1 [DE/DE]; Meerwiesenstrasse 21, 68163
`Mannheim (DE).
`
`(74) Anwalt: NEUEFEIND, Regina; Maiwald Patentanwalts
`GmbH, Elisenhof, Elisenstrasse 3, 80335 Miinchen (DE).
`
`(81) Bestimmungsstaaten (soweit nicht anders angegeben, fiir
`jede verfiigbare nationale Schutzrechtsart): AE, AG, AL,
`AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BW, BY, BZ, CA, CH,
`CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EC, EE, EG, ES,
`FT, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN,
`IS, JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR,
`LS, LT, LU, LV, LY, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX,
`MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PG, PH, PL, PT, RO,
`RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, SV, SY, TJ, TM,
`TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
`
`(84) Bestimmungsstaaten (soweit nicht anders angegeben, fiir
`jede verffigbare regionale Schutzrechtsan): ARIPO (BW,
`GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG,
`ZM, ZW), eurasisches (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU,
`TJ, TM), europ’ajsches (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK,
`EE, ES, FT, FR, GB, GR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC,
`NL, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG,
`CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
`Veroifentlicht:
`mit internationalem Recherchenbericht
`
`var Ablauf der fiir Anderungen der Anspriiche geltenden
`Frist; Verc’iflentlichung wird wiederholt, falls Anderungen
`eintreflen
`mit dem Sequenzprotokollteil der Beschreibung in elektro—
`nischer Form getrennt verc’iflentlicht; aquntrag mm In—
`ternationalen Biiro erha‘ltlich
`
`Zur Erkla'rung der Zweibuchstaben—Codes und der anderen Ab—
`kiirzungen wird auf die Erkla‘rungen (”Guidance Notes on C0—
`des and Abbreviations ”) am Anfangjeder reguldren Ausgabe der
`PCT—Gazette verwiesen.
`
`(54) Title: METHOD FOR PRODUCING POLYUNSATURATED FATTY ACIDS
`
`(54) Bezeichnung: VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON MEHRFACH UNGESATTIGTEN FETTSAUREN
`
`(57) Abstract: The invention relates to a method for producing eicosapentanoic acid, docosapentanoic acid and/or docohexanoic
`acid in transgenic plants. According to said method, the plant is provided with at least one nucleic acid sequence coding for a
`polypetide with a A6 desaturase activity, at least one nucleic acid sequence coding for a polypeptide with a A6 elongase activity, at
`H least one nucleic acid sequence coding for a polypeptide with a A5 desaturase activity, and at least one nucleic acid sequence coding
`for a polypeptide with a A5 elongase activity, the nucleic acid sequence coding for a polypeptide with a A5 elongase activity being
`modified in relation to the nucleic acid sequence in the organism from which the sequence originates, such that it is adapted to the
`[\ codon use in at least one type of plant. For the production of docosahexanoic acid, at least one nucleic acid sequence coding for a
`w polypeptide with a A4 desaturase activity is also introduced into the plant.
`63
`a (57) Zusammenfassung: Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaens'aure, Docosapenta—
`c ens'aure und/oder Docosahexaens'aure in transgenen Pflanzen, indem in der Pflanze bereitgestellt werden mindestens eine Nukleins'au—
`I: resequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A6—Desaturase—Aktivit'at kodiert; mindestens eine Nukleins'auresequenz, welche fiir
`c ein Polypeptid mit einer A6—Elongase—Aktivit'at kodiert; mindestens eine Nukleins'auresequenz, welche fur ein Polypeptid mit einer
`c A5—Desaturase—Aktivit'at kodiert; und mindestens eine Nukleins'auresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A5—Elongase—Ak—
`N tivit'at kodiert, wobei die Nukleins'auresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A5—Elongase—Aktivit'at kodiert, gegeniiber der
`Nukleins'auresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch veréindert ist, dass sie an die Kodonverwendung
`in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist. Fiir die Herstellung von Docosahexaens'aure wird zus'atzlich eine oder mehrere
`Nukleins'auresequenzen, die fiir ein Polypeptid mit einer A4—Desaturase—Aktivit'at kodiert, in die Pflanze eingebracht.
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`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
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`WO 2007/096387
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`PCT/EP2007/051675
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`Verfahren zur Herstellung V0n mehrfach ungeséittigten Fettséiuren
`
`Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung V0n Eicosapentaenséiure,
`
`Docosapentaenséiure und/oder Docosahexaenséiure in transgenen Pflanzen, indem in der
`
`Pflanze bereitgestellt werden mindestens eine Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein
`
`Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitéit kodiert; mindestens eine Nukleinséiuresequenz,
`
`welche fiir ein Polypeptid mit einer A6-E10ngase-Aktivitét kodiert; mindestens eine
`
`Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A5 -Desaturase-Aktivitéit kodiert;
`
`und mindestens eine Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A5 -Elongase-
`
`Aktivitéit kodiert,
`
`wobei die Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitéit
`
`kodiert, gegenfiber der Nukleinséiuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz
`
`stamnit, dadurch veréindert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer Oder mehreren
`
`Pflanzenarten angepasst ist.
`
`10
`
`15
`
`In einer bevorzugten Ausfiihrungsform werden zuséitzlich weitere Nukleinséiuresequenzen, die
`
`fiir ein Polypeptid mit der Aktivitéit einer oo3-Desaturase und/oder einer A4-Desaturase
`
`20
`
`kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`In einer weiteren bevorzugten Ausfiihrungsforni werden weitere Nukleinséiuresequenzen, die
`
`fiir Acyl-COA-Dehydr0genase(n), Acyl-ACP(= acyl carrier protein)—Desaturase(n), Acyl—
`
`ACP—Thioesterase(n), Fettséiure—Acyl—Transferase(n), Acyl-COA:Lysophospholipid-
`
`25
`
`Acyltransferase(n), Fettséiure—Synthase(n), Fettséiure—Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A—
`
`Carboxylase(n), Acyl—Coenzym A—Oxidase(n), Fettséiure—Desaturase(n), Fettséiure—
`
`Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol—Lipasen, Allenoxid—Synthasen,
`
`Hydroperoxid—Lyasen Oder Fettséiure—Elongase(n) kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
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`WO 2007/096387
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`PCT/EP2007/051675
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`Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Nukleinséiuremolekiile, umfassend mindestens
`
`eine Nukleinséiuresequenz, die fiir ein Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitéit kodiert;
`
`mindestens eine Nukleinséiuresequenz, die fiir ein Polypeptid mit einer A5 -Desaturase-
`
`Aktivitéit kodiert; mindestens eine Nukleinséiuresequenz, die fiir ein Polypeptid mit einer A6-
`
`Elongase-Aktivitéit kodiert; und mindestens eine Nukleinséiuresequenz, die fiir ein Polypeptid
`
`mit einer A5 -E10ngase-Aktivitéit kodiert und die gegeniiber der Nukleinséiuresequenz in dem
`
`Organismus, aus dem die Sequenz stammt, dadurch veréindert ist, dass sie an die
`
`Kodonverwendung in einer Oder mehreren Pflanzenarten angepasst ist.
`
`Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Ole, Lipide und/oder Fettséiuren, die nach dem
`
`erfindungsgeméifien Verfahren hergestellt wurden, und deren Verwendung.
`
`SchlieBlich betrifft die Erfindung auch transgene Pflanzen, die nach dem erfindungsgeméifien
`
`Verfahren hergestellt wurden Oder die ein erfindungsgeméiBes rekombinantes Nukleinséiure-
`
`molekiil enthalten, und deren Verwendung als Nahrungs— Oder Futtermittel.
`
`10
`
`15
`
`Die Lipidsynthese léisst sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese V0n Fettséiuren und
`
`ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Ph0sphat sowie die Addition Oder Modifikation einer polaren
`
`20
`
`Kopfgruppe. Ubliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide,
`
`Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettséiuresynthese beginnt mit der
`
`Umwandlung V0n Acetyl-COA in Malonyl-COA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase Oder in
`
`Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese
`
`beiden Produktmolekiile zusammen Acetoacetyl-ACP, das fiber eine Reihe V0n Konden-
`
`25
`
`sations—, Reduktions— und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt Wird, so dass ein
`
`geséittigtes Fettséiuremolekiil mit der gewiinschten Kettenléinge erhalten Wird. Die Produktion
`
`der ungeséittigten Fettséiuren aus diesen Molekiilen wird durch spezifische Desaturasen
`
`katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff Oder anaerob (bezfiglich
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`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
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`WO 2007/096387
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`PCT/EP2007/051675
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`der Fettsauresynthese in Mikroorganismen siehe F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und
`
`Salmonella. ASM Press: Washington, DC, S. 612-636 und darin enthaltene Literaturstellen;
`
`Lengeler et a1. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die
`
`enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson, K., et a1. (1993) Microbiological Reviews
`
`57:522-542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide
`
`gebundenen Fettsauren mussen anschlieBend fur die weiteren Elongationen aus den
`
`Phospholipiden wieder in den FettsaureCoA-Ester-Pool uberfiihrt werden. Dies ermoglichen
`
`Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen. Weiterhin konnen diese Enzyme die
`
`elongierten Fettsauren wieder von den CoA-Estern auf die Phospholipide ubertragen. Diese
`
`Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.
`
`Ferner mussen Fettsauren anschlieBend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und
`
`in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der
`
`Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsauren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise
`
`durch Glycerin-Fettsaure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5): 161-166).
`
`Eine Ubersicht uber die Pflanzen-Fettsaurebiosynthese, Desaturierung, den Lipidstoffwechsel
`
`und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation,
`
`Fettsauremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und —Assemblierung
`
`geben einschlieBlich der Literaturstellen die folgenden Artikel: Kinney (1997) Genetic
`
`Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19: 149-166; Ohlrogge und Browse (1995) Plant Cell 7:957-
`
`970; Shanklin und Cahoon (1998) Annu. ReV. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641;
`
`Voelker (1996) Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18: 1 1 1-13; Gerhardt (1992) Prog.
`
`Lipid R. 31:397-417; Guhnemann-Schafer & Kindl (1995) Biochim. Biophys Acta 1256:181-
`
`186; Kunau et a1. (1995) Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et a1. (1993) in: Biochemistry
`
`and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und
`
`SomerVille, RockVille, American Society of Plant Physiologists, 150-158; Murphy & Ross
`
`(1998) Plant Journal. 13(1):1-16.
`
`10
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`20
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`25
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`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
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`Die rnehrfach ungeséittigten Fettséiuren kfinnen entsprechend ihrem Desaturierungsmuster in
`
`zwei groBe Klassen, die 03-6- und die oa-3-Fettséiuren, eingeteilt werden, die metabolisch und
`
`filnktionell unterschiedliche AktiVitéiten haben.
`
`1m Folgenden werden mehrfach ungeséittigte Fettséiuren als PUFA, PUFAs, LCPUFA Oder
`
`LCPUFAs bezeichnet (poly finsaturated _fatty 2_1cids, PUFA, mehrfach ungeséittigte Fettséiuren;
`
`long chain p_01y finsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach ungeséittigte
`
`Fettséiuren).
`
`A1s Ausgangsstoff fiir den oa-6-St0ffwechse1weg fiJngiert die Fettséiure Linolséiure (18:2A9’12),
`
`Wéihrend der oa-3-Weg fiber Linolenséiure (18:3A9’12’15) abléiuft. Linolenséiure Wird dabei durch
`
`die AktiVitéit einer oa-3-Desaturase aus Linolséiure gebildet (Tocher et a1. (1998) Prog. Lipid
`
`Res. 37: 73-117 ; Domergue et a1. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 4105-4113).
`
`10
`
`15
`
`Séiugetiere und damit auch der Mensch verfiigen fiber keine entsprechende Desaturaseaktivitéit
`
`(A-12- und oa-3-Desaturase) zur Bildung dieser Ausgangsstoffe und mfissen daher diese
`
`Fettséiuren (essentielle Fettséiuren) fiber die Nahrung aufnehmen. Uber eine Abfolge V0n
`
`Desaturase- und Elongase-Reaktionen werden dann aus diesen Vorstufen die physiologisch
`
`20
`
`Wichtigen mehrfach ungeséittigten Fettséiuren Arachidonséiure (= ARA, 20:4A5’8’11’14), eine oa-
`
`6-Fettséiure und die beiden oa-3-Fetts'auren Eicosapentaen- (= EPA, 20:5A5’8’11’14’17) und
`
`Docosahexaenséiure (DHA, 22:6A4’7’10’13’17’19) synthetisiert.
`
`Die Verléingerung V0n Fettséiuren durch Elongasen um 2 bzw. 4 C-Atome ist ffir die
`
`25
`
`Produktion V0n C20- bzw. ng-PUFAs V0n entscheidender Bedeutung. Dieser Prozess verléiuft
`
`fiber 4 Stufen. Den ersten Schritt stellt die Kondensation V0n Malonyl-COA an das Fettséiure-
`
`Acyl-COA durch die Ketoacyl-CoA-Synthase (KCS, im weiteren Text als Elongase
`
`bezeichnet) dar. Es folgt dann ein Reduktionsschritt (Ketoacyl-CoA-Reduktase, KCR), ein
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`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
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`WO 2007/096387
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`PCT/EP2007/051675
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`Dehydratationsschritt (Dehydratase) und ein abschlieBender Reduktionsschritt (Enoyl-COA-
`
`Reduktase). Es wurde postuliert, dass die AktiVitat der Elongase die Spezifitat und
`
`Geschwindigkeit des gesamten Prozesses beeinflusst (Millar and Kunst (1997) Plant Journal
`
`122121-131).
`
`Fiir Fettsauren und Triacylglyceride besteht eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebens—
`
`mittelindustrie, der Tierernahrung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem, 0b es
`
`sich um freie gesattigte und ungesattigte Fettsauren oder um Triacylglyceride mit einem
`
`erhéhten Gehalt an gesattigten oder ungesattigten Fettsauren handelt, sind sie fiir die
`
`unterschiedlichsten Anwendungen geeignet. So werden z.B. in der humanen Ernahrung
`
`Lipide mit ungesattigten, speziell mehrfach ungesattigten, Fettsauren bevorzugt. Den
`
`mehrfach ungesattigten 03-3 -Fettsauren Wird dabei ein positiver Effekt auf den
`
`Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Pravention einer Herzerkrankung zuge-
`
`schrieben. Durch Zugabe dieser oa-3-Fettsauren zur Nahrung kann das Risiko einer
`
`Herzerkrankung, eines Schlaganfalls Oder V0n Bluthochdruck deutlich verringert werden
`
`(Shimikawa (2001) World ReV. Nutr. Diet. 88: 100-108).
`
`Auch entziindliche, speziell chronisch entzfindliche, Prozesse im Rahmen immunologischer
`
`Erkrankungen Wie rheumatoider Arthritis lassen sich durch oo-3-Fettsauren positiV
`
`beeinflussen (Calder (2002) Proc. Nutr. Soc. 61: 345-358; Cleland und James (2000)
`
`J. Rheumatol. 27: 2305-2307). Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell diatetischen
`
`Lebensmitteln, zugegeben Oder finden in Medikamenten Anwendung. oo-6-Fettsauren Wie
`
`Arachidonsaure fiben bei diesen rheumatischen Erkrankungen eher einen negativen Effekt
`
`3.118 .
`
`03-3- und oa-6-Fettsauren sind Vorlaufer V0n Gewebshormonen, den sogenannten
`
`Eicosanoiden Wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo-y-linolensaure,
`
`der Arachidonsaure und der Eicosapentaensaure ableiten, und den Thromboxanen und
`
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`CSIRO Exhibit 1003
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`Leukotrienen, die sich Von der Arachidonséiure und der Eicosapentaenséiure ableiten.
`
`Eicosanoide (sog. PGz-Serie), die aus w-6-Fettséiuren gebildet werden, férdern in der Regel
`
`Entzfindungsreaktionen, wéihrend Eicosanoide (sog. PG3-Serie) aus oa-3-Fettséiuren geringe
`
`Oder keine entziindungsférdernde Wirkung haben.
`
`Mehrfach ungeséittigte langkettige oa-3-Fettséiuren Wie Eicosapentaenséiure (= EPA,
`
`C2025A5’8’11’14’17) Oder Docosahexaenséiure (= DHA, C2226A4’7’10’13’16’19) sind wichtige
`
`Komponenten der menschlichen Ern'eihrung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in der
`
`Gesundheit, die Aspekte wie die Entwicklung des kindlichen Gehirns, die Funktionalitét des
`
`Auges, die Synthese VOl’l Hormonen und anderer Signalstoffe, sowie die Vorbeugung von
`
`Herz-Kreislauf—Beschwerden, Krebs und Diabetes umfassen (Poulos, A (1995) Lipids 30: 1-
`
`14; Horrocks, LA und Yeo YK (1999) Pharmacol Res 402211-225).
`
`Aufgrund der heute fiblichen Zusarnmensetzung der menschlichen Nahrung ist ein Zusatz VOl’l
`
`mehrfach ungeséittigten 03-3 -Fettséiuren, die bevorzugt in Fischélen vorkommen, zur Nahrung
`
`besonders Wichtig. So werden beispielsweise mehrfach ungeséittigte Fettséiuren wie Docosa-
`
`hexaenséiure (= DHA, C2226A4’7’10’13’16’19) oder Eisosapentaenséiure (= EPA, C2025A5’8’11’14’17)
`
`der Babynahrung zur Erhéhung des Néihrwertes zugesetzt. Es besteht aus diesem Grund ein
`
`Bedarf an der Produktion mehrfach ungeséittigter langkettiger Fettséiuren.
`
`Hauptséichlich werden die verschiedenen Fettséiuren und Triglyceride aus Mikroorganismen
`
`Wie Mortierella Oder Schizochytrium Oder aus Cl—produzierenden Pflanzen Wie Soj a, Raps
`
`und Algen Wie Crypthecodinium Oder Phaeodactylurn und weiteren gewonnen, wobei sie in
`
`der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Triglycerole) anfallen. Sie kénnen
`
`aber auch aus Tieren wie z.B. Fischen gewonnen werden. Die freien Fettséiuren werden
`
`vorteilhaft durch Verseifung der Triacylglyceride hergestellt. Sehr langkettige mehrfach
`
`ungeséittigte Fettséiuren Wie DHA, EPA, Arachidonséiure (ARA, C2024A5’8’11’14), Dihomo-y-
`
`linolenséiure (DHGL, C2023A8’11’14) Oder Docosapentaenséiure (DPA, C2225A7’10’13’16’19)werden
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`PCT/EP2007/051675
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`in 0lfruchtpflanzen Wie Raps, Soj a, Sonnenblume, Farbersaflor j edoch nicht synthetisiert.
`
`Ubliche natiirliche Quellen fiir diese Fettsauren sind Fische Wie Hering, Lachs, Sardine,
`
`Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch oder Algen.
`
`Aufgrund der positiven Eigenschaften der mehrfach ungesattigten Fettsauren hat es in der
`
`Vergangenheit nicht an Ansatzen gefehlt, Gene, die an der Synthese dieser Fettsauren bzw.
`
`Triglyceride beteiligt sind, fiir die Herstellung von 0len in verschiedenen Organismen
`
`mit geandertem Gehalt an ungesattigten Fettsauren verfiigbar zu machen. So Wird in
`
`W0 91/ 13972 und seinem US—Aquivalent eine A—9—Desaturase beschrieben. In
`
`10
`
`W0 93/11245 Wird eine A—15—Desaturase und in WO 94/11516 eine A—12—Desaturase
`
`beansprucht. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP—A—0 550 162, WO 94/18337,
`
`W0 97/30582, W0 97/21340, W0 95/18222, EP—A—0 794 250, Stukey et al. (1990) J. Biol.
`
`Chem, 265: 20144-20149, Wada et al. (1990) Nature 347: 200—203 oder Huang et al. (1999)
`
`Lipids 34: 649—659 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen
`
`Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membran-
`
`gebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und zu charakterisieren sind (McKeon et al.
`
`(1981) Methods in Enzymol. 71: 12141—12147, Wang et al. (1988) Plant Physiol. Biochem.,
`
`26: 777—792).
`
`In der Regel erfolgt die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen durch Ein-
`
`bringung in einen geeigneten Organismus, der anschlieBend auf EnzymaktiVitat mittels
`
`Edukt- und Produktanalyse untersucht Wird. A—6—Desaturasen werden in W0 93/06712,
`
`US 5,614,393, W0 96/21022, W0 00/21557 und W0 99/27111 beschrieben. Die Anwendung
`
`dieses Enzyms zur Produktion von Fettsauren in transgenen Organismen Wird in
`
`W0 98/46763, W0 98/46764 und W0 98/46765 beschrieben. Die Expression verschiedener
`
`Desaturasen und die Bildung mehrfach ungesattigter Fettsauren Wird auch in W0 99/64616
`
`oder W0 98/46776 beschrieben und beansprucht. Bzgl. der EffektiVitat der Expression von
`
`Desaturasen und ihrem Einfluss auf die Bildung mehrfach ungesattigter Fettsauren ist
`
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`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
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`PCT/EP2007/051675
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`anzumerken, dass durch Expression einer einzelnen Desaturase Wie bisher beschrieben
`
`lediglich geringe Gehalte an ungesattigten Fettsauren/Lipiden Wie z.B. y-Linolensaure und
`
`Stearidonsaure erreicht wurden.
`
`In der Vergangenheit wurden zahlreiche Versuche unternommen, Elongase-Gene zu erhalten.
`
`Millar and Kunst (1997) Plant Journal 12: 121-131 und Millar et al. (1999) Plant Cell 11:825-
`
`838 beschreiben die Charakterisierung von pflanzlichen Elongasen zur Synthese von einfach
`
`ungesattigten langkettigen Fettsauren (C22: 1) bzw. zur Synthese von sehr langkettigen
`
`Fettsauren fiir die Wachsbildung in Pflanzen (ng-C32). Beschreibungen zur Synthese von
`
`Arachidonsaure und EPA finden sich beispielsweise in WO 01/59128, W0 00/ 12720,
`
`WO 02/077213 und WO 02/08401. Die Synthese von mehrfach ungesattigter C24-Fettsauren
`
`ist beispielsweise in Tvrdik et al. (2000) J. Cell Biol. 149: 707-718 oder in WO 02/44320
`
`beschrieben.
`
`Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAs sind Mikroalgen Wie
`
`Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-Arten, Thraustochytrien-Arten, Schizochytrien-
`
`Arten oder Crypthecodinium—Arten, Ciliaten, Wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, Wie
`
`Mortierella, Entomophthora oder Mucor und/oder Moose Wie Physcomitrella, Ceratodon und
`
`Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K.
`
`Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and
`
`Biotechnology 73: 269-278). Durch Stammselektion ist eine Anzahl von Mutantenstammen
`
`der entsprechenden Mikroorganismen entwickelt worden, die eine Reihe Wfinschenswerter
`
`Verbindungen, einschlieBlich PUFAs, produzieren. Die Mutation und Selektion von Stammen
`
`mit verbesserter Produktion eines bestimmten Molekiils Wie den mehrfach ungesattigten
`
`Fettsauren ist j edoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Mit Hilfe der vorge-
`
`nannten Mikroorganismen lassen sich zudem nur begrenzte Mengen der gewiinschten
`
`mehrfach ungesattigten Fettsauren Wie DPA, EPA oder ARA herstellen, die noch dazu in der
`
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`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
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`Regel a1s Fettsauregemische anfa11en. Deshalb werden, wann immer moglich, gentechno-
`
`logische Verfahren bevorzugt.
`
`Hohere Pflanzen enthalten mehrfach ungesattigte Fettsauren Wie Linolsaure (C 1 8:2) und
`
`Linolensaure (C1823). ARA, EPA und DHA kommen im Samenol hoherer Pflanzen gar nicht
`
`oder nur in Spuren vor (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales. Technique &
`
`Documentation — Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Es Ware jedoch vorteilhaft, in
`
`hoheren Pflanzen, bevorzugt in Glsaaten Wie Raps, Lein, Sonnenblume und Soj a, LCPUFAs
`
`herzustellen, da auf diese Weise groBe Mengen qualitatiV hochwertiger LCPUFAs fiir die
`
`Lebensmittelindustrie, die Tieremahrung und fiir pharmazeutische Zwecke kostengfinstig
`
`gewonnen werden konnen. Hierzu werden vorteilhafterweise fiber gentechnische Methoden
`
`Gene, die fiir Enzyme der Biosynthese von LCPUFAs kodieren, in Glsaaten eingefiihrt und
`
`exprimiert. Dies sind Gene, die beispielsweise fiir A-6-Desaturasen, A-6-Elongasen, A-5-
`
`Desaturasen oder A-4-Desaturasen kodieren. Diese Gene konnen vorteilhaft aus Mikro-
`
`organismen und niederen Pflanzen isoliert werden, die LCPUFAs herstellen und in den
`
`Membranen oder Triacylglyceriden einbauen. So konnten bereits A-6-Desaturase-Gene aus
`
`dem Moos Physcomitrella patens und A-6-Elongase-Gene aus P. patens und dem Nematoden
`
`C. elegans isoliert werden.
`
`Transgene Pflanzen, die fiir Enzyme der LCPUFA-Biosynthese kodierende Gene enthalten
`
`und exprimieren und a1s Folge dessen LCPUFAs produzieren, wurden beispielsweise in
`
`DE-A-102 19 203 (Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesattigter Fettsauren in Pflanzen)
`
`beschrieben. Diese Pflanzen produzieren allerdings LCPUFAs in Mengen, die fiir eine
`
`Aufarbeitung der in den Pflanzen enthaltenen Ole noch weiter optimiert werden miissen. So
`
`betragt der Gehalt von ARA in den in DE-A-102 19 203 beschriebenen Pflanzen 1edig1ich 0,4
`
`bis 2% und der Gehalt von EPA 1edig1ich 0,5 bis 1%, j eweils bezogen auf den Gesamt-
`
`lipidgehalt der Pflanze.
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`Um eine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit mehrfach ungeséittigten, langkettigen
`
`Fettséiuren zu erméglichen, besteht daher ein groBer Bedarf an einem einfachen, kosten-
`
`giinstigen Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungeséittigten, langkettigen Fettséiuren
`
`speziell in pflanzlichen Systemen.
`
`Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem langkettige,
`
`mehrfach ungeséittigte Fettséiuren, insbesondere Eicosapentaenséiure, Docosapentaenséiure
`
`und/Oder Docosahexaenséiure, in transgenen Pflanzen in groBer Menge preiswert hergestellt
`
`werden kénnen.
`
`Es wurde nun fiberraschenderweise herausgefimden, dass durch die Expression einer
`
`optimierten AS-Elongase-Sequenz in transgenen Pflanzen die Ausbeute an langkettigen,
`
`mehrfach ungeséittigten Fettséiuren, insbesondere Eicosapentaenséiure, Docosapentaenséiure
`
`und/oder Docosahexaenséiure, gesteigert werden kann.
`
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`Die durch das erfindungsgeméifie Verfahren hergestellten PUFAs umfassen eine Gruppe von
`
`Molekiilen, die héhere Tiere nicht mehr synthetisieren kennen und somit aufnehmen mfissen
`
`Oder die héhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen kennen und somit zuséitzlich
`
`aufnehmen miissen, obwohl sie leicht VOl’l anderen Organismen, Wie Bakterien, synthetisiert
`
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`
`werden kennen.
`
`Entsprechend Wird die Aufgabe der Erfindung gelést durch das erfindungsgeméifie Verfahren
`
`zur Herstellung von Eicosapentaenséiure, Docosapentaenséiure und/oder Docosahexaenséiure
`
`in einer transgenen Pflanze, umfassend das Bereitstellen in der Pflanze VOl’l mindestens einer
`
`25
`
`Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitéit kodiert;
`
`mindestens einer Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A6-Elongase-
`
`Aktivitéit kodiert; mindestens einer Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer
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`CSIRO Exhibit 1003
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`AS-Desaturase-Aktivitéit kodiert; und mindestens einer Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein
`
`Polypeptid mit einer AS-Elongase-Aktivitéit kodiert,
`
`wobei die Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer AS-Elongase-Aktivitéit
`
`kodiert, gegeniiber der Nukleinséiuresequenz in dem Organismus, aus dem die Sequenz
`
`stammt, dadurch veréindert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren
`
`Pflanzenarten angepasst ist. Fiir die Produktion von DHA muss desweiteren mindestens eine
`
`Nukleinséiuresequenz, welche fiir ein Polypeptid mit einer A4-Desaturase-Aktivitéit kodiert, in
`
`der Pflanze bereitgestellt werden.
`
`Das "Bereitstellen in der Pflanze" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass
`
`MaBnahnien getroffen werden, so dass die Nukleinséiuresequenzen kodierend fiir ein
`
`Polypeptid mit einer A6-Desaturase-Aktivitéit, ein Polypeptid mit einer A6-Elongase-
`
`Aktivitéit, ein Polypeptid mit einer A5 -Desaturase-Aktivitéit und ein Polypeptid mit einer A5-
`
`Elongase-Aktivitéit zusammen in einer Pflanze vorliegen. Das "Bereitstellen in der Pflanze"
`
`umfasst somit das Einbringen der Nukleinséiuresequenzen in die Pflanze sowohl durch Trans-
`
`formation einer Pflanze mit einem oder mehreren rekombinanten Nukleinséiureniolekiilen, die
`
`die genannten Nukleinséiuresequenzen enthalten, als auch durch Verkreuzung von geeigneten
`
`Elternpflanzen, die eine oder mehrere der genannten Nukleinséiuresequenzen enthalten.
`
`Die Nukleinséiuresequenz, die fiir ein Polypeptid mit einer AS-Elongase-Aktivitéit kodiert, ist
`
`erfindungsgeniéiB gegeniiber der Nukleinséiuresequenz in dem Organismus, aus dem die
`
`Sequenz stammt, dadurch veréindert, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder
`
`mehreren Pflanzenarten angepasst ist. Dies bedeutet, dass die Nukleinséiuresequenz gezielt fiir
`
`die Zwecke der Erfindung optimiert wurde, ohne dass dadurch die von der
`
`Nukleinséiuresequenz kodierte Aminoséiuresequenz veréindert wurde.
`
`Der genetische Code ist redundant, da er 61 Kodons verwendet, um 20 Aminoséiuren zu
`
`spezifizieren. Daher werden die meisten der 20 proteinogenen Aminoséiuren von mehreren
`
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`Tripletts (Kodons) kodiert. Die synonymen Kodons, die eine einzelne Aminosaure spezi-
`
`fizieren, werden in einem bestimmten Organismus jedoch nicht mit gleicher Haufigkeit
`
`verwendet, sondern es gibt bevorzugte Kodons, die haufig verwendet werden und Kodons, die
`
`seltener verwendet werden. Diese Unterschiede in der Kodonverwendung werden zuriick-
`
`5
`
`gefiihrt auf selektive evolutionare Driicke und vor allem die Effizienz der Translation. Ein
`
`Grund fiir die geringere Translationseffizienz von selten auftretenden Kodons konnte darin
`
`liegen, dass die entsprechenden Aminoacyl-tRNA-Pools erschopft werden und damit nicht
`
`mehr zur Proteinsynthese zur Verfiigung stehen.
`
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`
`AuBerdeni bevorzugen unterschiedliche Organismen unterschiedliche Kodons. Daher lauft
`
`beispielsweise die Expression einer rekombinanten DNA, die aus einer Séiugerzelle stammt,
`
`in E. coli-Zellen haufig nur suboptimal ab. Deshalb kann der Austausch selten verwendeter
`
`Kodons gegen haufig verwendete Kodons in manchen Fallen die Expression erhohen. Ohne
`
`an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die kodonoptimierten
`
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`
`DNA-Sequenzen eine effizientere Translation ermoglichen und die daraus gebildeten mRNAs
`
`moglicherweise eine hohere Halbwertszeit in der Zelle besitzen und daher haufiger fiir die
`
`Translation zur Verfiigung stehen. Aus dem vorstehend gesagten folgt, dass eine
`
`Kodonoptimierung nur dann notig ist, wenn der Organismus, in dem die Nukleinsauresequenz
`
`exprimiert werden soll, ein anderer ist als der Organismus, aus dem die Nukleinsauresequenz
`
`20
`
`urspriinglich stammt.
`
`Fiir Viele Organismen, von denen die DNA-Sequenz einer groBeren Zahl von Genen bekannt
`
`ist, gibt es Tabellen, denen man die Haufigkeit der Verwendung bestimmter Kodons in dem
`
`j eweiligen Organismus entnehmen kann. Mit Hilfe dieser Tabellen lassen sich Protein-
`
`25
`
`sequenzen mit relatiV groBer Genauigkeit in eine DNA-Sequenz zuriickiibersetzen, die die
`
`im jeweiligen Organismus bevorzugten Kodons fiir die verschiedenen Aminosauren des
`
`Proteins enthalt. Tabellen zur Kodonverwendung konnen u.a. unter der folgenden Internet-
`
`Adresse aufgefunden werden:
`
`CSIRO Exhibit 1003
`CSIRO Exhibit 1003
`
`

`

`WO 2007/096387
`
`PCT/EP2007/051675
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`
`http_://www.kazusa.or.jp_/Kodon/E.html. Dariiber hinaus bieten mehrere Firmen Software fiir
`
`die Genoptimierung an, wie z.B. die Firma Entelechon (Software Leto) oder die Firma
`
`Geneart (Software GeneOptimizer).
`
`Die Anpassung der Sequenzen an die Kodonverwendung in einem bestimmten Organismus
`
`kar1r1 ur1ter Zuhilfenahme verschiederier Kriterien erfolgen. Zum eir1er1 kar1r1 fiir eine
`
`bestimmte Aminosaure immer das am haufigsten im ausgewahlten Organismus vorkommende
`
`Kodon verwendet werden, zum anderen kar1r1 aber auch die natiirliche Frequenz der ver-
`
`schiedenen Kodons berficksichtigt werden, so dass alle Kodons fiir eine bestimmte
`
`Aminosaure entsprechend ihrer natiirlichen Haufigkeit in die optimierte Sequenz eingebaut
`
`werden. Dabei kar1r1 die Auswahl, an welcher Position welches Basen-Triplett verwendet
`
`wird, zufallig stattf1r1der1. ErfindungsgemaB wurde die DNA-Sequenz unter Berficksichtigung
`
`der natiirlichen Haufigkeit einzelner Kodons angepasst, wobei die Verwendung des am
`
`haufigsten im ausgewahlten Organismus vorkommenden Kodons ebenfalls geeignet ist.
`
`Besonders bevorzugt ist eine Nukleinsauresequenz aus Ostreococcus tauri, die fiir
`
`eir1 Polypeptid mit einer A5-Elor1gase-Aktivitatkodiert, wie beispielsweise das in SEQ ID No.
`
`110 dargestellte Polypeptid, zumindest an die Kodonverwendung ir1 Raps, Soj a und/oder Lein
`
`angepasst. Bei der urspri'mglich aus Ostreococcus tauri stammenden Nukleinsauresequenz
`
`handelt es sich bevorzugt um die in SEQ ID No. 109 )dargestellte Sequenz. Die fiir