Eu ropaisches Patentamt
`GD1
`
`European Patent Office
`DG1
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`Otfice européen cles brevets
`DG1
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`9
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`Bescheinigung
`
`Certificate
`
`Attestation
`
`Die angehefteten Unterlagen
`stimmen mit der urspriJnglich
`eingereichten Fassung der
`auf dem nachsten Blatt
`
`bezeichneten europaischen
`Patentanmeldung flberein.
`
`The attached documents are
`
`exact copies of the
`European patent application
`described on the following
`page, as originally filed.
`
`Les documents fixes a cette
`attestation sont conformes a
`la version initialement
`
`déposée de la demande de
`brevet européen spécificée a
`la page suivante.
`
`Patentanmeldung Nr.
`
`Patent application No.
`
`Demande de brevet n°
`
`061203097 / EP06120309
`
`The organization code and number of your priority application, to be used for filing abroad under the Paris
`Convention, is EP06120309
`
`Der Président des Européischen Patentamts;
`lm Auttrag
`For the President of the European Patent Office
`Le President de I'Office européen des brevets
`p.o.
`
`I
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`h
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`'5 2 ‘h
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`FLO. van Dijk
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`EPA/EPOIOEB Form 1014
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`AF02090
`CSIRO Exhibit 1005
`CSIRO Exhibit 1005
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`Europaisches Patentamt
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`European Patent Office
`DG1
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`Otfioe européen cles brevets
`DG1
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`Anmeldetag:
`Date of filing:
`Date de dépot:
`
`07.09.06
`
`Anmeldung Nr:
`Application no:
`Demande no:
`
`06120309]
`
`Anmelder/Applicant(s)lDemandeu r(s):
`
`BASF Plant Science GmbH
`Carl-Bosch-Strasse 64
`
`67117 Limburgerhof/DE
`
`Bezeichnung der Erfindung/Title of the invention/Titre de I'invention:
`(Falls die Bezeichnung der Erfindung nicht angegeben ist, siehe Beschreibung.
`If no title is shown please reierto the description.
`Si aucun titre n'est indiqué se referer a la description.)
`
`Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesattigten Fettsauren
`
`In anspruch genommene Prioritat(en) I Priority(ies) claimed / Priorité(s) revendiquée(s)
`Staat/Tag/Aktenzeichen / State/Date/File no. / Pays/Date/Numéro de dépot:
`
`Internationale Patentklassifikation / International Patent Classification / Classification internationale de brevets:
`
`C12N1/00
`
`Am Anmeldetag benannte Vertragstaaten / Contracting states designated at date of filing / Etats contractants désignées Iors du dépét:
`
`AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GFI HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TFI
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`EPA/EPOIOEB Form 1014
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`CSIRO Exhibit 1005
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`Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungeséttigten Fettséuren
`
`Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Eicosapentaenséure,
`
`Docosapentaenséure und/oder Docosahexaenséure in transgenen Pflanzen, indem in
`
`der Pflanze bereitgestellt werden mindestens eine Nukleinséuresequenz, welche fflr ein
`
`Polypeptid mit einer AG—Desaturase-Aktivitét kodiert; mindestens eine Nuklein—
`
`séuresequenz, welche fUr ein Polypeptid mit einer A6—Elongase—Aktivitét kodiert; mindes-
`
`tens eine Nukleinséuresequenz, welche fflr ein Polypeptid mit einer A5-Desaturase—
`
`Aktivitét kodiert; und mindestens eine Nukleinséuresequenz, welche fflr ein Polypeptid
`
`mit einer A5—Elongase-Aktivitét kodiert,
`
`wobei die Nukleinséuresequenz, welche fUr ein Polypeptid mit einer A5—Elongase—
`
`Aktivitét kodiert, gegenUber der Nukleinséuresequenz in dem Organismus, aus dem die
`
`Sequenz stammt, dadurch veréndert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder
`
`mehreren Pflanzenarten angepasst ist.
`
`In einer bevorzugten Ausfflhrungsform werden zusétzlich weitere Nukleinséure-
`
`sequenzen, die fUr ein Polypeptid mit der Aktivitét einer w3—Desaturase und/oder ei—
`
`ner A4-Desaturase kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`In einer weiteren bevorzugten Ausfflhrungsform werden weitere Nukleinséuresequenzen,
`
`die fUr Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), AcyI-ACP(= acyl carrier protein)—Desaturase(n),
`
`Acyl—ACP—Thioesterase(n), Fettséure—Acyl—Transferase(n), Acyl-CoAzLysophospholipid—
`
`Acyltransferase(n), Fettséure—Synthasem), Fettséure—Hydroxylasem), Acetyl-Coenzym
`
`A—Carboxylase(n), AcyI—Coenzym A—Oxidase(n), Fettséure—Desaturasem), Fettséure—
`
`Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol—Lipasen, Allenoxid—Synthasen, Hydrope—
`
`roxid-Lyasen oder Fettséure—Elongasem) kodieren, in der Pflanze bereitgestellt.
`
`Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Nukleinséuremolekflle, umfassend mindes-
`
`tens eine Nukleinséuresequenz, die fUr ein Polypeptid mit einer AG-Desaturase—Aktivitét
`
`kodiert; mindestens eine Nukleinséuresequenz, die fUr ein Polypeptid mit einer A5-
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`Desaturase-Aktivitat kodiert; mindestens eine Nukleinsauresequenz, die fl'Jr ein Polypep-
`
`tid mit einer A6-Elongase-Aktivitat kodiert; und mindestens eine Nukleinsauresequenz,
`
`die fiir ein Polypeptid mit einer A5-Elongase—Aktivitat kodiert und die gegeniiber der Nuk—
`
`leinsauresequenz in dem Organismus, aus dem die Seq uenz stammt, dadurch verandert
`
`ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder mehreren Pflanzenarten angepasst
`
`ist.
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`Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Ole, Lipide und/oder Fettsauren, die nach dem
`
`erfindungsgemaisen Verfahren hergestellt wurden, und deren Verwendung.
`
`SchlieBlich betrifft die Erfindung auch transgene Pflanzen, die nach dem erfindungs—
`
`gemaiSen Verfahren hergestellt wurden oder die ein erfindungsgemaBes rekombinantes
`
`Nukleinsauremolekfll enthalten, und deren Verwendung als Nahrungs— oder Futtermittel.
`
`Die Lipidsynthese lasst sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsauren
`
`und ihre Bindung an sn—Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer
`
`polaren Kopfgruppe. Ubliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen
`
`Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsauresynthese
`
`beginnt mit der Umwandlung von AcetyI—CoA in Malonyl—CoA durch die Aoetyl—COA—
`
`Carboxylase oder in Acetyl—ACP durch die Acetyltransacylase. Naoh einer Kondensati—
`
`onsreaktion bilden diese beiden Produktmolekiile zusammen Acetoacetyl-ACP, das Uber
`
`eine Reihe von Kondensations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umge-
`
`wandelt wird, so dass ein gesattigtes Fettsauremolekiil mit der gewiinschten Kettenlange
`
`erhalten wird. Die Produktlon der ungesattigten Fettsauren aus diesen Molektilen wird
`
`durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekula—
`
`rem Sauerstoff oder anaerob (beztiglich der Fettsauresynthese in Mikroorganismen sie-
`
`he F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., S.
`
`612-636 und darin enthaltene Literaturstellen; Lengeler et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of
`
`Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie
`
`Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522—542 und die enthaltenen
`
`Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide gebundenen Fettsauren miJ'ssen
`
`anschlieBend fUr die weiteren Elongationen aus den Phospholipiden wieder in den Fett—
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`saureCoA—Ester-Pool Uberfl'jlhrt werden. Dies ermoglichen Acyl-CoA:Lysophospholipid-
`
`Acyltransferasen. Weiterhin konnen diese Enzyme die elongierten Fettsauren wieder
`
`von den CoA-Estern auf die Phospholipide Ubertragen. Diese Reaktionsabfolge kann
`
`gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.
`
`Ferner mUssen Fettsauren anschlieBend an verschiedene Modifikationsorte transportlert
`
`und in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt
`
`bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsauren auf die polaren Kopfgruppen, bei—
`
`spielsweise durch Glycerin-Fettsaure—Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid,
`
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`
`100(4—5):161-166).
`
`Eine Ubersicht fiber die Pflanzen-Fettsaurebiosynthese, Desaturierung, den Llpld-
`
`stoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation,
`
`Fettsauremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und —Assemblierung
`
`geben einschlieBlich der Literaturstellen die folgenden Artikel: Kinney (1997) Genetic
`
`Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 192149-166; Ohlrogge und Browse (1995) Plant Cell
`
`7:957—970; Shanklin und Cahoon (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
`
`49:611—641;Voelker (1996) Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 182111-13;
`
`Gerhardt (1992) Prog. Lipid R. 31:397—417; GUhnemann—Schafer & Kindl (1995) Biochim.
`
`Biophys Acta 1256:181—186; Kunau et al. (1995) Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et
`
`al. (1993) in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of
`
`Plants, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiolo—
`
`gists, 150-158; Murphy & Ross (1998) Plant Journal. 13(1):1-16.
`
`Die mehrfach ungesattigten Fettsauren konnen entsprechend ihrem Desaturierungs-
`
`muster in zwei grofLe Klassen, die w—G- und die w—3—Fettsauren, eingeteilt werden, die
`
`metabolisch und funktionell unterschiedliche Aktivitaten haben.
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`lm Folgenden werden mehrfach unges'attigte Fettsauren als PUFA, PUFAs, LCPUFA
`
`oder LCPUFAS bezeichnet (poly unsaturated fatty acids, PU FA, mehrfach ungesattigte
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`Fettsauren; long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach un-
`
`gesattigte Fettsauren).
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`Als Ausgangsstoff fiir den w—6—Stoffwechselweg fungiert die Fettséure Linolséure
`
`(18:2A9v12), wéhrend der w-B—Weg Uber Linolenséure (18:3A9’1215) abléuft. Linolenséure
`
`wird dabei durch die Aktivitét einer w—3-Desaturase aus Linolséure gebiidet (Tocher et al.
`
`(1998) Prog. Lipid Res. 37: 73—1 17 ; Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 4105-
`
`41 13).
`
`Séugetiere und damit auch der Mensch verfiigen iiber keine entsprechende Desaturase—
`
`aktivitét (A—12- und w-3—Desaturase) zur Bildung dieser Ausgangsstoffe und mflssen da—
`
`her diese Fettséiuren (essentielle Fettséuren) fiber die Nahrung aufnehmen. Uber eine
`
`Abfolge von Desaturase— und Elongase—Reaktionen werden dann aus diesen Vorstufen
`
`die physiologisch wichtigen mehrfach ungeséttigten Fettséuren Arachidonséure (= ARA,
`
`20:4A5'8-11’14), eine w—6—Fettséure und die beiden w—3—Fettséuren Eicosapentaen— (= EPA,
`
`2051353111417) und Docosahexaenséure (DHA, 22;5A4.7.10.13.17,19) synthetisiert.
`
`Die Verléngerung von Fettséiuren durch Elongasen um 2 bzw. 4 C-Atome ist fiir die Pro-
`
`duktion von Czo- bzw. sz-PUFAS von entscheidender Bedeutung. Dieser Prozess ver—
`
`léuft fiber 4 Stufen. Den ersten Schritt stellt die Kondensation von Malonyl-COA an das
`
`Fettséure—Acyl—COA durch die Ketoacyl—CoA—Synthase (KCS, im weiteren Text als Elon—
`
`gase bezeichnet) dar. Es folgt dann ein Reduktionsschritt (Ketoacyl-CoA-Reduktase,
`
`KCR), ein Dehydratationsschritt (Dehydratase) und ein abschlieflaender Reduktionsschritt
`
`(Enoyl—CoA—Reduktase). Es wurde postuliert, dass die Aktivitét der Elongase
`
`die Spezifitét und Geschwindigkeit des gesamten Prozesses beeinfiusst (Miller and
`
`Kunst (1997) Plant Journal 12:121-131).
`
`Fl'Jr Fettséuren und Triacylglyceride besteht eine Vielzahl von Anwendungen in der Le-
`
`bensmittelindustrie, der Tierernéhrung, der Kosmetik und im Pharmabereich.
`
`Je nachdem, ob es sich um freie geséttigte und ungeséttigte Fettséuren oder um Tria—
`
`cylglyceride mit einem erhéhten Gehalt an geséittigten oder ungeséttigten Fettséuren
`
`handelt, sind sie fl'Jr die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet. So werden 2.8. in
`
`der humanen Ernéhrung Lipide mit ungeséttigten, speziell mehrfach ungeséttigten, Fett-
`
`séuren bevorzugt. Den mehrfach ungeséttigten w—3—Fettséuren wird dabei ein positiver
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`Effekt auf den Cholesterinspiegei im Blut und damit auf die Prévention einer Herzerkran—
`
`kung zugeschrieben. Durch Zugabe dieser w-3-Fettséuren zur Nahrung kann das Risiko
`
`einer Herzerkrankung, eines Schlaganfalls oder von Bluthochdruck deutlich verringert
`
`werden (Shimikawa (2001) World Rev. Nutr. Diet. 88: 100-108).
`
`Auch entziindiiche, spezieil chronisch entziindiiche, Prozesse im Rahmen immuno-
`
`iogischer Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis lassen sich durch w—3-Fettséuren po-
`
`sitiv beeinflussen (Calder (2002) Proc. Nutr. Soc. 61: 345-358; Cleland und James
`
`(2000) J. Rheumatol. 27: 2305-2307). Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell di'eite-
`
`tischen Lebensmitteln, zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung.
`
`w—G—Fettséuren wie Arachidonséure Liben bei diesen rheumatischen Erkrankungen e—
`
`her einen negativen Effekt aus.
`
`w-3— und w-G-Fettséuren sind Vorléufer von Gewebshormonen, den sogenannten
`
`Eicosanoiden wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo—y—Iinolenséure,
`
`der Arachidonséure und der Eicosapentaenséure abieiten, und den Thromboxanen und
`
`Leukotrienen, die sich von der Arachidonséure und der Eicosapentaenséure ableiten.
`
`Eicosanoide (sog. PGz—Serie), die aus w—B-Fetts'aiuren gebildet werden, fijrdern in
`
`der Regel Entzijndungsreaktionen, wéhrend Eicosanoide (sog. PGa—Serie) aus w—3—
`
`Fettséuren geringe oder keine entz'L'Indungstjrdernde Wirkung haben.
`
`Mehrfach ungeséttigte iangkettige w-3-Fettséuren wie Eicosapentaenséure (= EPA,
`
`C20:5A5’8v11)14v17) oder Docosahexaenséure (= DHA, (322:5A4.7.10.13,16,19) sind wichtige
`
`Komponenten der menschlichen Ernéhrung aufgrund ihrer verschiedenen Roilen in der
`
`Gesundheit, die Aspekte wie die Entwickiung des kindlichen Gehirns, die Funktionalitét
`
`des Auges, die Synthese von Hormonen und anderer Signalstoffe, sowie die Vorbeu-
`
`gung von Herz—Kreislauf—Beschwerden, Krebs und Diabetes umfassen (Pouios, A (1995)
`
`Lipids 30:1-14; Horrocks, LA und Yeo YK (1999) Pharmacol Res 402211-225).
`
`Aufgrund der heute Liblichen Zusammensetzung der menschiichen Nahrung ist ein Zu—
`
`satz von mehrfach ungeséttigten w-3-Fettséuren, die bevorzugt in Fischbien vorkom—
`
`men, zur Nahrung besonders wichtig. So werden beispieisweise mehrfach ungeséttigte
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`Fettsauren wie Docosahexaensaure (= DHA, C22:6A4v7~10v13v16’19) oder Eisosapentaensau-
`
`re (= EPA, C2O:5A5’8’11y14v17) der Babynahrung zur Erhohung des Néhrwertes zugesetzt.
`
`Es besteht aus diesem Grund ein Bedarf an der Produktion mehrfach ungesattigter lang-
`
`kettiger Fettséiu ren.
`
`Hauptsachlich werden die verschiedenen Fettsauren und Triglyceride aus Mikro-
`
`organismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Ol—produzierenden Pflanzen
`
`wie Soja, Raps und Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum und weiteren ge-
`
`wonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Tri-
`
`glycerole) anfallen. Sie konnen aber auch aus Tieren wie z.B. Fischen gewonnen wer-
`
`den. Die freien Fettséuren werden vorteilhaft durch Verseifung der Triacylglyceride her—
`
`gestellt. Sehr langkettige mehrfach ungesattigte Fettsauren wie DHA, EPA, Araohidon-
`
`saure (ARA, C20:4A5’8y11.14), Dihomo-v—linolenséure (DHGL, C20:3A8v11,14) oder Docosa—
`
`pentaensaure (DPA, C22:5A7:1‘113s15’19) werden in Olfruohtpflanzen wie Raps, Soja, Son-
`
`nenblume, Farbersaflorjedooh nicht synthetisiert. Ubliche natCIrliChe Quellen fiir diese
`
`Fettsauren sind Fische wie Hering, Laohs, Sardine, Goldbarsoh, Aal, Karpfen, Forelle,
`
`Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisoh oder Algen.
`
`Aufgrund der positiven Eigenschaften der mehrfach ungeséttigten Fetts'auren hat es in
`
`der Vergangenheit nicht an Ansatzen gefehlt, Gene, die an der Synthese dieser Fettséu—
`
`ren bzw. Triglyceride beteiligt sind, fiir die Herstellung von Olen in verschiedenen Orga-
`
`nismen mit geandertem Gehalt an ungesattigten Fettséuren verfijgbar zu machen. So
`
`wird in WO 91/13972 und seinem US—Aquivalent eine A—9—Desaturase beschrieben. ln
`
`WO 93/11245 wird eine A—15—Desaturase und in WC 94/1 1516 eine A-12—Desaturase
`
`beansprucht. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP—A—0 550 162,
`
`WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP—A—0 794 250, Stukey
`
`et al. (1990) J. Biol. Chem., 265: 20144-20149, Wada et al. (1990) Nature 347: 200—203
`
`oder Huang et al. (1999) Lipids 34: 649—659 beschrieben. Die biochemische Charakteri-
`
`sierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureiohend erfolgt, da
`
`die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und zu Cha—
`
`rakterisieren sind (MoKeon et al. (1981) Methods in Enzymol. 71: 12141—12147, Wang et
`
`al. (1988) Plant Physiol. Biochem., 26: 777—792).
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`In der Regel erfolgt die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen duroh Ein-
`
`bringung in einen geeigneten Organismus, der anschlieBend auf Enzymaktivit'at mittels
`
`Edukt— und Produktanalyse untersucht wird. A-G—Desaturasen werden in WO 93/06712,
`
`US 5,614,393, WO 96/21022, WO 00/21557 und WO 99/27111 besohrieben. Die An-
`
`wendung dieses Enzyms zur Produktion von Fettsauren in transgenen Organismen wird
`
`in WO 98/46763, WO 98/46764 und WO 98/46765 beschrieben. Die Expression ver-
`
`schiedener Desaturasen und die Bildung mehrfach ungesattigter Fettsauren wird auch in
`
`WO 99/64616 oder WO 98/46776 besohrieben und beanspruoht. Bzgl. der Effektivitat
`
`der Expression von Desaturasen und ihrem Einfluss auf die Bildung mehrfach ungesat—
`
`tigter Fettséuren ist anzumerken, dass durch Expression einer einzelnen Desaturase wie
`
`bisher beschrieben lediglich geringe Gehaite an ungesattigten Fettsauren/Lipiden wie
`
`z.B. v—Linolensaure und Stearidonsaure erreicht wurden.
`
`In der Vergangenheit wurden zahlreiche Versuche unternommen, Elongase—Gene
`
`zu erhaiten. Millar and Kunst (1997) Plant Journal 12:121-131 und Millar et al. (1999)
`
`Plant Cell 11:825—838 besohreiben die Charakterisierung von pflanzlichen Elongasen zur
`
`Synthese von einfach ungesattigten langkettigen Fettsauren (C22:1) bzw. zur Synthese
`
`von sehr langkettigen Fettsauren fijr die Wachsbildung in Pflanzen (028-032). Beschrei—
`
`bungen zur Synthese von Arachidonsaure und EPA finden sich beispielsweise in WO
`
`01/59128, WO 00/12720, WO 02/077213 und WO 02/08401. Die Synthese von mehrfach
`
`ungesattigter C24-Fettsauren ist beispielsweise in Tvrdik et al. (2000) J. Cell Biol. 149:
`
`707—71 8 oder in WO 02/44320 beschrieben.
`
`Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PU FAs sind Mikroalgen wie
`
`Phaeodactylum trioornutum, Porphiridium—Arten, Thraustochytrien—Arten, Schizochytrien—
`
`Arten oder Crypthecodinium—Arten, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, wie
`
`Mortierella, Entomophthora oder Mucor und/oder Moose wie Physcomitrella, Ceratodon
`
`und Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Tota—
`
`ni & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060—1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry
`
`and Biotechnology 73: 269-278). Durch Stammselektion ist eine Anzahl von Mutanten—
`
`stammen der entsprechenden Mikroorganismen entwiokelt worden, die eine Reihe wUn-
`
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`schenswerter Verbindungen, einschlielLlich PUFAs, produzieren. Die Mutation
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`und Selektion von Stéimmen mit verbesserter Produktion eines bestimmten Molekiils wie
`
`den mehrfach ungesattigten Fettséuren ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges
`
`Verfahren. Mit Hilfe der vorgenannten Mikroorganismen lassen sich zudem nur begrenz-
`
`te Mengen der gewiinschten mehrfach ungeséttigten Fettsauren wie DPA, EPA oder
`
`ARA hersteilen, die noch dazu in der Regel als Fetts'auregemische anfallen. Deshalb
`
`werden, wann immer moglich, gentechnologische Verfahren bevorzugt.
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`Hohere Pflanzen enthalten mehrfach ungesattigte Fettséuren wie Linolsaure (018:2) und
`
`Linolenséure (C18:3). ARA, EPA und DHA kommen im Samenol hoherer Pflanzen gar
`
`nicht oder nur in Spuren vor (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales.
`
`Technique & Documentation - Lavoisier, 1995. ISBN: 2—7430—0009—0). Es ware jedoch
`
`vorteilhaft, in hoheren Pflanzen, bevorzugt in Olsaaten wie Raps, Lein, Sonnenblume
`
`und Soja, LCPUFAs herzustellen, da auf diese Weise groiLe Mengen qualitativ hochwer—
`
`tiger LCPUFAs fUr die Lebensmittelindustrie, die Tierernahrung und fijr pharmazeutisohe
`
`Zwecke kostengiinstig gewonnen werden konnen. Hierzu werden vorteilhafterweise [iber
`
`gentechnische Methoden Gene, die fiir Enzyme der Biosynthese von LCPUFAs kodie—
`
`ren, in Glsaaten eingeffihrt und exprimiert. Dies sind Gene, die beispieisweise fCIr A-6—
`
`Desaturasen, A—6—Elongasen. A—5—Desaturasen oder A—4—Desaturasen kodieren. Diese
`
`Gene konnen vorteilhaft aus Mikroorganismen und niederen Pflanzen isoiiert werden, die
`
`LCPUFAs hersteilen und in den Membranen oder Triacylgiyceriden einbauen. So konn-
`
`ten bereits A—6—Desaturase-Gene aus dem Moos Physcomitrella patens und A—6-
`
`EIongase-Gene aus P. patens und dem Nematoden C. elegans isoiiert werden.
`
`Transgene Pflanzen, die fiir Enzyme der LCPUFA-Biosynthese kodierende Gene enthal—
`
`ten und exprimieren und als Folge dessen LCPUFAs produzieren, wurden beispieiswei-
`
`se in DE-A—102 19 203 (Verfahren zur Herstellung mehrfach ungeséttigter Fettsauren in
`
`Pflanzen) beschrieben. Diese Pflanzen produzieren allerdings LCPUFAs in Mengen, die
`
`fiir eine Aufarbeitung der in den Pflanzen enthaltenen Ole noch weiter optimiert werden
`
`mLissen. So betrégt der Gehalt von ARA in den in DE-A-102 19 203 beschriebenen
`
`Pflanzen lediglich 0,4 bis 2% und der Gehalt von EPA lediglich 0,5 bis 1%, jeweils bezo—
`
`gen auf den Gesamtlipidgehalt der Pflanze.
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`Um eine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit mehrfach ungeséttigten, lang—
`
`kettigen Fettséuren zu erméglichen, besteht daher ein groBer Bedarf an einem einfa-
`
`chen, kostengiinstigen Verfahren zur Hersteiiung von mehrfach ungeséttigten, langketti-
`
`gen Fettséuren speziell in pfianzlichen Systemen.
`
`Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzusteilen, mit dem langket—
`
`tige, mehrfach ungeséittigte Fettséuren, insbesondere Eicosapentaenséure, Docosapen-
`
`taenséure und/oder Docosahexaenséure, in transgenen Pflanzen in groBer Menge
`
`preiswert hergesteiit werden kbnnen.
`
`Es wurde nun Uberraschenden/veise herausgefunden, dass durch die Expression einer
`
`optimierten A5—Eiongase-Sequenz in transgenen Pflanzen die Ausbeute an langkettigen,
`
`mehrfach ungeséttigten Fettséuren, insbesondere Eicosapentaenséure, Docosa—
`
`pentaenséure und/oder Docosahexaenséure, gesteigert werden kann.
`
`Die durch das erfindungsgeméfle Verfahren hergesteilten PUFAs umfassen eine Gruppe
`
`von Molekflien, die héhere Tiere nicht mehr synthetisieren kénnen und somit aufnehmen
`
`miissen oder die héhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstelien kbnnen und so—
`
`mit zusétzlich aufnehmen mijssen, obwohl sie ieicht von anderen Organismen, wie Bak-
`
`terien, synthetisiert werden kénnen.
`
`Entsprechend wird die Aufgabe der Erfindung gelést durch das erfindungsgeméfle Ver—
`
`fahren zur Herstellung von Eicosapentaenséure, Docosapentaenséure und/oder Doco-
`
`sahexaenséure in einer transgenen Pflanze, umfassend das Bereitstellen in der Pflanze
`
`von mindestens einer Nukieinséuresequenz, welche fl'Jr ein Polypeptid mit einer A6-
`
`Desaturase—Aktivitét kodiert; mindestens einer Nukleinséuresequenz, welche fijr ein Po-
`
`lypeptid mit einer A6—Eiongase—Aktivitét kodiert; mindestens einer Nukleinséuresequenz,
`
`welche fl'Jr ein Polypeptid mit einer A5—Desaturase-Aktivitét kodiert; und mindestens einer
`
`Nukleinséuresequenz, welche fijr ein Polypeptid mit einer A5-Eiongase—Aktivitét kodiert,
`
`wobei die Nukieinséuresequenz, welche fijr ein Polypeptid mit einer A5—Eiongase—
`
`Aktivitét kodiert, gegenijber der Nukieinséuresequenz in dem Organismus, aus dem die
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`Sequenz stammt, dadurch verandert ist, dass sie an die Kodonverwendung in einer oder
`
`mehreren Pflanzenarten angepasst ist. Fiir die Produktion von DHA muss desweiteren
`
`mindestens eine Nukleinsauresequenz, welche fl'Jr ein Polypeptid mit einer A4—
`
`Desaturase—Aktivitét kodiert, in der Pflanze bereitgestellt werden.
`
`Das “Bereitstellen in der Pflanze" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, dass
`
`Maanahmen getroffen werden, so dass die Nukleinséuresequenzen kodierend fflr ein
`
`Polypeptid mit einer AG—Desaturase—Aktivitat, ein Polypeptid mit einer AG-Elongase-
`
`Aktivitat, ein Polypeptid mit einer A5—Desaturase—Aktivitat und ein Polypeptid mit einer
`
`A5—EIongase-Aktivitat zusammen in einer Pflanze vorliegen. Das "Bereitstellen in der
`
`Pflanze“ umfasst somit das Einbringen der Nukleinsauresequenzen in die Pflanze so—
`
`wohi durch Transformation einer Pflanze mit einem oder mehreren rekombinanten Nuk-
`
`leinsauremolekfllen, die die genannten Nukleinséuresequenzen enthalten, als auch
`
`durch Verkreuzung von geeigneten Eiternpflanzen, die eine oder mehrere der genannten
`
`Nukleinséuresequenzen enthalten.
`
`Die Nukleinséuresequenz, die filr ein Polypeptid mit einer A5—Eiongase—Aktivitat kodiert,
`
`ist erfindungsgeméfs gegenlliber der Nukleinséuresequenz in dem Organismus, aus dem
`
`die Sequenz stammt, dadurch veréndert, dass sie an die Kodonverwendung in einer o—
`
`der mehreren Pfianzenarten angepasst ist. Dies bedeutet, dass die Nukleinsaurese-
`
`quenz gezielt filr die Zwecke der Erfindung optimiert wurde, ohne dass dadurch die von
`
`der Nukleinsauresequenz kodierte Aminosauresequenz veréndert wurde.
`
`Der genetische Code ist redundant, da er 61 Kodons verwendet, um 20 Aminosauren zu
`
`spezifizieren. Daher werden die meisten der 20 proteinogenen Aminoséiuren von mehre-
`
`ren Tripletts (Kodons) kodiert. Die synonymen Kodons, die eine einzelne Aminosaure
`
`spezifizieren, werden in einem bestimmten Organismus jedoch nicht mit gleicher Haufig-
`
`keit verwendet, sondern es gibt bevorzugte Kodons, die haufig verwendet werden und
`
`Kodons, die seltener verwendet werden. Diese Unterschiede in der Kodonvenrvendung
`
`werden zurl'llckgefflhrt auf selektive evolutionare Driicke und vor aliem die Effizienz der
`
`Translation. Ein Grund fiir die geringere Translationseffizienz von seiten auftretenden
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`Kodons konnte darin liegen, dass die entsprechenden Aminoacyl-tRNA-Pools erschopft
`
`werden und damit nicht mehr zur Proteinsynthese zur Verfijlgung stehen.
`
`AuBerdem bevorzugen unterschiedliche Organismen unterschiedliche Kodons. Daher
`
`lauft beispieisweise die Expression einer rekombinanten DNA, die aus einer Séugerzelle
`
`stammt, in E. coii-Zellen haufig nur suboptimal ab. Deshalb kann der Austausch selten
`
`verwendeter Kodons gegen haufig venNendete Kodons in manchen Fallen die Expressi—
`
`on erhohen. Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass
`
`die kodonoptimierten DNA-Sequenzen eine effizientere Translation ermoglichen und die
`
`daraus gebildeten mRNAs moglicherweise eine hohere Halbwertszeit in der Zelle besit—
`
`zen und daher haufiger ftir die Translation zur Verftigung stehen. Aus dem vorstehend
`
`gesagten folgt, dass eine Kodonoptimierung nur dann notig ist, wenn der Organismus, in
`
`dem die Nukleinsauresequenz exprimiert werden soll, ein anderer ist als der Organis—
`
`mus, aus dem die Nukleinsauresequenz ursprflnglich stammt.
`
`Ftir viele Organismen, von denen die DNA—Sequenz einer groBeren Zahl von Genen be—
`
`kannt ist, gibt es Tabellen, denen man die Haufigkeit der Verwendung bestimmter Ko-
`
`dons in dem jeweiligen Organismus entnehmen kann. Mit Hilfe dieser Tabellen lassen
`
`sich Proteinsequenzen mit relativ groBer Genauigkeit in eine DNA—Sequenz zuriJck—
`
`'Libersetzen, die die im jeweiligen Organismus bevorzugten Kodons fiJr die verschiedenen
`
`Aminosauren des Proteins enth'alt. Tabellen zur Kodonverwendung konnen u.a. unter
`
`der folgenden lnternet—Adresse aufgefunden werden:
`
`httpjfimwwukazusa(orIgprodonfEuhtmi. Dariiber hinaus bieten mehrere Firmen Software
`
`fiir die Genoptimierung an, wie z.B. die Firma Entelechon (Software Leto) oder die Firma
`
`Geneart (Software GeneOptimizer).
`
`Die Anpassung der Sequenzen an die Kodonverwendung in einem bestimmten Orga—
`
`nismus kann unter Zuhiifenahme verschiedener Kriterien erfolgen. Zum einen kann fijr
`
`eine bestimmte Aminosaure immer das am haufigsten im ausgewahlten Organismus
`
`vorkommende Kodon verwendet werden, zum anderen kann aber auch die nattirliche
`
`Frequenz der verschiedenen Kodons beriicksichtigt werden, so dass alle Kodons fiir ei—
`
`ne bestimmte Aminosaure entsprechend ihrer natijrlichen Haufigkeit in die optimierte
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`Sequenz eingebaut werden. Dabei kann die AuswahI, an weIcher Position weIches Ba-
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`sen-TripIett verwendet wird, zuf'eiIIig stattfinden. ErfindungsgeméB wurde die DNA-
`
`Sequenz unter BerUcksichtigung der natiJrIIchen Héufigkeit einzelner Kodons angepasst,
`
`wobei die Verwendung des am héufigsten im ausgewéhiten Organismus vorkommenden
`
`Kodons ebenfaIIs geeignet ist.
`
`Besonders bevorzugt ist eine NukIeinséuresequenz aus Ostreococcus tauri, die fiJr
`
`ein Polypeptid mit einer A5-Elongase-Aktivitét kodiert, wie beispielsweise das in Seq ID
`
`No. 110 dargestellte Ponpeptid, zumindest an die Kodonverwendung in Raps, Soja
`
`und/oder Lein angepasst. Bei der urspriinglich aus Ostreococcus tauri stammenden Nuk—
`
`Ieinséuresequenz handelt es sich bevorzugt um die in Seq ID No. 109 )dargestellte Se—
`
`quenz. Die fiir die A5-Elongase kodierende DNA—Sequenz ist an mindestens 20% der
`
`Positionen, bevorzugt an mindestens 30% der Positionen, besonders bevorzugt an min—
`
`destens 40% Positionen und am meisten bevorzugt an mindestens 50% der Positionen
`
`an die Kodonverwendung in Raps, Soja und/oder Lein angepasst.
`
`Am meisten bevorzugt handeIt es sich bei der verwendeten NukIeinséuresequenz um die
`
`in SEQ ID No. 64 angegebene Sequenz.
`
`Es versteht sich, dass auch solche kodonoptimierten DNA-Sequenzen von der Erfindung
`
`erfasst sind, die fUr ein Ponpeptid mit der Aktivitét einer A5—Elongase kodieren, dessen
`
`Aminoséuresequenz an einer oder mehreren Positionen gegenflber der WiIdtyp—Sequenz
`
`veréindert ist, das aber noch im wesentlichen die gleiche Aktivitét aufweist wie das WiId-
`
`typ—Protein.
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`Bevorzugt ist die NukIeinséuresequenz, die fiir ein Polypeptid mit einer A6—Desaturase-
`
`Aktivitét kodiert, ausgewéhlt aus der Gruppe bestehend aus:
`
`a) NukIeInséuresequenzen mit der in Seq ID NO.
`
`1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39 oder 41, bevorzugt mit der in
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`Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz,
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`b) NukIeinséuresequenzen, die fUr die in Seq ID No.
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`2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40 oder 42, bevorzugt in Seq ID
`
`No. 2 angegebene Aminoséuresequenz kodieren,
`
`c) NukIeinséuresequenzen, die mit dem kompIementéren Strang der a) oder b) oberhalb
`
`angegebenen NukIeinséuresequenzen, insbesondere der in Seq ID No. 1 angegebenen
`
`NukIeinséuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren,
`
`d) NukIeInséuresequenzen, die zu den in a) oder b) oberhalb angegebenen NukIeinséu—
`
`resequenzen, insbeondere zur der In Seq ID No. 1 angegebenen Sequenz zu mindes-
`
`tens 60%, 65%, 70%, 75% oder 80%, bevorzugt zu mindestens 81%, 82%, 83%, 84%,
`
`85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, besonders bevorzugt zu mindestens 91%, 92%,
`
`93%, 94% oder 95% und insbesondere zu mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% iden—
`
`tisch sind, und
`
`e) NukIeInséuresequenzen, die fUr eine Aminoséuresequenz kodieren, die mindestens
`
`eines, beispielsweise 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, vorzugsweise aIIe der in Seq ID No.
`
`43,44,45,46,47,48,49 oder 5O angegebenen Aminoséurepattern aufweisen.
`
`Unter Aminoséurepattern sind kurze Aminoséuresequenzen zu verstehen, die vorzugs—
`
`weise weniger 31$ 50, besonders bevorzugt weniger aIs 40 und insbesondere von 10 bis
`
`40 und noch weiter bevorzugt von 10 bis 30 Aminoséuren umfassen.
`
`Fl'Jr die vorIiegende Erfindung wird die Identitét vorzugsweise Uber die VoIIénge der er—
`
`findungsgeméfien Nukleotid- oder Aminoséuresequenzen ermitteIt, beispielsweise fCIr
`
`die in SEQ ID NO: 64 angegebene Nukleinséuresequenz Uber die V